apII连接，构建另一个重组载体pMA5-HapII-gdh ;然后以重组 载体pMA5-HapII-gdh为模板，利用引物P4和P5通过PCR技术扩增出带有启动子HapII的 基因片段HapII-gdh ;最后，将该基因片段通过限制性内切酶Mlu I处理后，与同样经过Mlu I处理和去磷酸化处理的载体pMA5-HapII-acr在T4DNA连接酶的作用下16°C过夜连接，将 连接液转化至大肠杆菌感受态E. coli JM109中，挑取阳性转化子，提取转化子中的质粒，经 酶切验证并确认重组质粒pMA5-HapII-acr-HapII-gdh构建成功。
[0013] 以B. amyloliquefaciens基因组总DNA为模板，PCR扩增引物设计如下：
[0015] (2)质粒 pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR 构建具体过程如下：
[0016] 首先，以B. subtilis菌株的染色体DNA为模板，利用引物P6/P7和P8/P9引 物对，通过PCR技术分别扩增得到PbdhA启动子片段（专利申请公布号CN 102876703 A)和核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的alsR基因；接着，将纯化后的PbdhA片段经 限制性内切酶EcoRI和EcoRV消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒 pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh 连接，构建重组质粒 pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA ;随后 将纯化的alsR基因与质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA，构建重组质粒pMA5_HpaII -acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。将重组质粒pM A5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR以电击转化的方法转化至B. subtilis，挑取阳性转 化子，即得到重组枯草芽孢杆菌GAR。
[0017] 实施例2 :菌原始菌及重组菌的发酵性能验证
[0018] ⑴种子培养
[0019] 从活化平板上挑取单菌落接种于种子培养基中，种子培养温度37°C，摇床转速 160r/min，培养时间为12h左右，种子培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L〇
[0020] (2)发酵培养
[0021] 初始发酵培养体积为2. 5L，米用的发酵培养基成分如下：
[0022] 发酵培养基成分：甘油80g/L，甜菜糖蜜15g/L (或蔗糖10g/L)，玉米浆5g/L，尿素 3g/L，柠檬酸钠6g/L，K2HPO4 4g/L，MgSO4 0· 2g/L ;将上述发酵培养基用5mol/L的NaOH调 节其pH至6. 5,在121°C下高温灭菌30min。
[0023] 发酵发酵条件：将上述培养好的种子液按4%接种量接种于发酵培养基中进行发 酵培养，发酵温度37°C，空气流量为120m3/h · m3培养基，搅拌转速为350r/min。定时取样 测定细胞浓度、底物残留量和3-羟基-2- 丁酮产量。发酵结束后，发酵液中产物2, 3- 丁二 醇和乙偶姻用气相色谱测定（GC-1690J气相色谱仪，杭州科晓化工仪器公司）。色谱条件如 下：毛细管柱，30mX0. 32mm色谱柱中固定液为AT. SE-30，，检测器为FID，柱温150°C，汽化 室与检测器的温度均为250°C，载气为N2，流速0.1 Mpa，进样量2 μ L，采用外标法定量。利 用液相色谱分析发酵液中有机酸含量。色谱条件：色谱柱为KC-811，流动相A为4mM高氯 酸，流动相8为超纯水，流动相梯度为0~7.511^1125%~75%4,7.51~151^1175%六，流 动相流速为1.0 mL/min，紫外检测波长为210nm，进样量为20 μ 1，柱温为60°C。结果发现， 与原始菌株相比，重组菌2, 3- 丁二醇产量提高了 17. 2%，副产物如乙偶姻、乳酸和丁二酸 的积累分别降低69. 2%、45. 2%和47. 4%，且发酵周期有所缩短。
[0024] (3)补料流加发酵培养
[0025] 种子培养基发酵培养条件和实施例3(1)和3(2)相同，当发酵液中甘油残留浓度 低于15g/L，通过补料栗一次性补加30-40g/L左右的甘油，当甘油糖消耗速率低于3g/L ·1ι 时停止补料，当残留在发酵液中的甘油被消耗完时结束发酵。通过补料流加发酵，2, 3-丁二 醇产量达到102. 6g/L。
【主权项】
1. 一种重组质粒，其特征在于：将SEQIDNO:1所示的乙偶姻还原酶基因acr，SEQID NO:2所示的甘油脱羧酶基因gdh和SEQIDNO:3所示的alsR调控子基因共同克隆到穿梭 载体pMA5-HpaII_PbdhA构建成为重组穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA_a IsR2. -种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：将权利要求1所述重组质粒转化至保藏编号 为CTCCM2009200的枯草芽孢杆菌中，获得重组枯草芽孢杆菌。3. -种应用于2, 3- 丁二醇合成的菌株，其特征在于：权利要求2所述的菌株。
【专利摘要】本发明从Bacillus？subtilis？CTCC？M2009200中克隆出参与2,3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因甘油脱氢酶(gdh)和乙偶姻还原酶(acr)以及调控2,3-丁二醇支路关键酶酶活的调控因子aslR，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gdh,acr和aslR基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh-PbdhA-alsR，并转入Bacillus？subtilis？CTCC？M2009200中，获得加强gdh,acr和alsR基因表达的重组枯草芽孢杆菌(命名为GAR)。对原始菌以及重组菌GAR进行利用甘油发酵生产2,3-丁二醇实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌2,3-丁二醇产量提高了17.2％，副产物如乙偶姻、乳酸和丁二酸的积累分别降低69.2％、45.2％和47.4％，且发酵周期有所缩短。通过补料流加甘油，发酵48h，发酵液中2,3-丁二醇积累量达到102.6g/L，这是现有技术所不能达到的结果。
【IPC分类】C12R1/125, C12N15/75, C12N1/21, C12P7/18
【公开号】CN105177034
【申请号】
【发明人】饶志明, 杨套伟, 胡桂元, 刘梅, 戴悦, 刘畅, 李磊, 周昌洋, 张显, 徐美娟
【申请人】江南大学, 江南大学（如皋）食品生物技术研究所, 如皋江大食品生物技术研究所有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月24日