一种基因工程菌及其在利用甘油生产2,3-丁二醇中的应用
【技术领域】
[0001] -种基因工程菌及其在利用甘油发酵生产2, 3-丁二醇中的应用，属于生物工程 中基因工程和发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原 料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越 来越受到国内外的高度重视。生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源，以其具有环保 和可再生性受到世界各国的关注，该产业在全球范围内迅速发展。但其经济性仍然不能与 传统的化石能源相抗衡。其原因主要有两方面：一方面是原料油脂价格较高；另一方面就 是副产物甘油没有得到很好的综合利用。在生物柴油的生产过程中可得到约10%的副产物 甘油，在原料端成本无法有效控制的前提下，如何对副产物粗甘油进行深度开发，已成为生 物柴油产业可持续发展的关键和保障，同时也是无法回避的关键问题。如果能够利用生物 柴油副产物甘油开发高附加值产品（如1，3-丙二醇、乙二醇、2, 3-丁二醇等），就能有效地 降低生物柴油生产成本、提高资源利用率、延伸产业链，是建立高效、经济的生物质能源综 合利用产业的重要措施，将大大提升生物柴油产业的整体技术水平和循环效益。
[0003] 2, 3- 丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航 天等领域。2, 3- 丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果； 在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2- 丁酮（乙偶姻）是一种应用广泛的天然食用香料； 脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于 涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1，3- 丁二烯可用于合成橡胶、ABS树 脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2, 3- 丁二醇是一种极具价 值的液体燃料，其燃烧值与甲醇（22. lkj/g)、乙醇（29. OkJ/g)相当。另外，2, 3-丁二醇及 其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。
[0004] 近年来用糖质原料发酵生产2, 3- 丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物 法生产2, 3- 丁二醇尚未实现工业化。然而从2, 3- 丁二醇的应用前景、生产技术成熟度、 知识产权状况及未来发展趋势看，开发以廉价的非粮糖质为原料（如生物柴油副产物粗甘 油）发酵生产2, 3-丁二醇具有很好的发展前景。目前报道的2, 3-丁二醇生产菌株多为克 雷伯氏菌属（Klebsiella)肠杆菌属（Enterobacter)和沙雷氏菌属（Serratia)等，但这些 菌大都是用糖质原料发酵生产2, 3- 丁二醇，而在国内利用粗甘油为原料生产2, 3- 丁二醇 还未见报道；另外，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求。因此， 使用安全菌种利用甘油发酵2, 3- 丁二醇具有良好的工业化前景。申请人前期公开了一种 利用一株安全菌株Bacillus subtilis CTCC M2009200发酵生物柴油副产物粗甘油生产 2, 3- 丁二醇的方法（ZL201210360637. 2)，为生物柴油副产物粗甘油进行工业化深度开发 提供了基础。但是，该菌株发酵效率较低，不适合工业化生产要求，本发明基于此，对该菌株 进行基因工程改造，提高其利用甘油合成2, 3- 丁二醇的效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基因工程改造 Bacillus subtilis CTCC M2009200的方 法，提高其利用甘油发酵生产2, 3- 丁二醇的效率。
[0006] 本发明所使用菌种为Bacillus subtilis CTCC M2009200(已保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号为：CTCC M2009200,相关信息已在专利ZL201210360637. 2中 公开）。本发明首先从Bacillus subtilis CTCC M2009200中克隆出参与2, 3-丁二醇合 成途径中辅酶循环再生的关键酶基因甘油脱氢酶（gdh)和乙偶姻还原酶（acr)以及调控 2, 3- 丁二醇支路关键酶酶活的调控因子aslR，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连 接，成功构建了携带基因 gdh, acr和aslR基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh -PbdhA-alsR，并转入 Bacillus subtilis CTCC M2009200 中，获得加强 gdh，acr 和 alsR 基 因表达的重组枯草芽孢杆菌（命名为GAR)。并对原始菌及重组菌GAR利用甘油合成2, 3-丁 二醇发酵性能检测，说明加强gdh, acr和alsR基因的表达能够提高2, 3- 丁二醇产量，降低 副产物如3-羟基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的积累。
[0007] 基于以上研究，对原始菌以及重组菌GAR进行利用甘油发酵生产2, 3-丁二醇实 验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌2, 3- 丁二醇产量提高了 17. 2 %，副产物如乙偶姻、 乳酸和丁二酸的积累分别降低69. 2%、45. 2%和47. 4%，且发酵周期有所缩短。为了进一 步提高重组菌的发酵性能，我们采用补料流加，发酵48h，发酵液中2, 3- 丁二醇积累量达到 102. 6g/L，这是现有技术所不能达到的结果。
[0008] 本发明的有益效果：
[0009] 本发明人所用菌株是一株安全菌株B. subtilis，通过加强辅酶循环再生速率提高 B. subtilis合成2, 3- 丁二醇效率，并减少发酵过程中副产物如3-羟基-2- 丁酮、乙酸、乳 酸和丁二酸等的积累，这有利于提高生产效率，降低生产成本。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 :目的基因的扩增及重组枯草芽孢杆菌的构建
[0011] (1)质粒 pMA5-HpaII-acr-HapII-gdh 构建具体过程如下：
[0012] 首先，以B. subtilis菌株的染色体DNA为模板，利用引物Pl和P2,通过PCR技术 扩增得到一段901bp大小的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的acr基因，将纯化后的acr 基因经限制性内切酶NdeI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒 pMA5-HapII连接（pMA5-HapII质粒相关信息已在申请人前期申请的专利中公开，【申请号】 201310342415. 2)，构建重组质粒pMA5-HapII-acr，经双酶切验证后，表明该重组质粒构建 成功。随后，利用引物P3和P4通过PCR扩增得到核苷酸序列为SEQ ID NO :2所示的基因 gdh，将纯化后的acr基因经限制性内切酶BamHI和MluI消化后，与同样经过上述两种限制 性内切酶消化的质粒pMA5-H