不佳的 HuVH2aSS，HuVH6aSS，HuV κ 5aSS，HuV κ 6aSS，HuV λ 5SS 引物 (针对低拷贝或单拷贝抗体基因引物）采用半巢式PClUsemi-nested PCR)进行扩增。在第 一轮PCR后，上述引物分别与cDNA合成所用的逆转录引物配对进行PCR，然后取2 μ L反应 产物，按上述条件进行第二轮PCR，扩增结果如图1中B所示，结果显示低拷贝和单拷贝基 因通过半巢式PCR，最终也能有效的扩增出VH、VL。然后纯化PCR产物，分别等量合并重链、 κ、λ轻链可变区基因扩增产物，命名为VH mix，VL-κ mix，VL-λ mix，-20°C保存备用。
[0033] 通过重叠延伸PCR的方式分别连接重链与κ轻链可变区基因扩增产物及重链与 λ轻链可变区基因扩增产物，构成VL-Iinker-VH scFv基因片段。具体方法如下：IOOng VH mix 和 IOOng VL- κ mix 或 VL- λ mix，25pmol scFvSS 和 scFvAS 引物，上述条件进行 PCR，结 果如图1中C所示。结果显示，通过重叠延伸PCR分别连接VH与VL κ、VL λ，获得了预计 750bp的scFv基因片段。纯化PCR产物，-20°C保存备用。
[0034] 实施例4、人源性抗多亚基因型HCV scFv噬菌体展示库的构建
[0035] 米用 T7 Select?. Phage Display System(Novagen)构建 scFv 卩策菌体展不库。根 据人正常的抗体轻链κ，λ比例，按摩尔比例2 :1将经EcoR I和Hind III双酶消化回收 纯化的Vh-Iinker-VL κ及Vh-Iinker-VL λ scFv片段混合，然后与T7噬菌体载体连接。连 接反应按试剂盒操作，具体方法如下：在5yL连接反应体系中，包括0.5yL 10XT4 DNA Ligase Buffer，0. 12pmoL混合scFv片段，0· 04pmoL 同样内切酶线性化的T7SelectlO_3b载 体臂，0. 5 μ L T4 DNA连接酶（NEB)，连接反应在16°C下孵育16小时。然后在连接产物中加 入25 μ L T7 Select Packaging Extract，22°C连接2小时，进行菌体体外包装，最后加入 270 μ L LB培养基终止反应，获得人抗-HCV scFv原始噬菌体展示库。从300 μ L原始展示 库中取出10 μ L进行噬斑测定，以确定原始库容大小，经检测滴定总库容达到3. 6Χ IO7PFU, 并随机挑选12个噬斑克隆，用scFvSS和scFvAS引物PCR扩增克隆的scFv基因并做核酸 序列分析，以确定原始库的多样性，scFv克隆的氨基酸序列如表2所示。
[0036] 表2、噬菌体原始展示库中随机挑选的12个scFv克隆的氨基酸序列
[0037] A
CN 105177017 A 说明书 8/10 页
[0041] A表示轻链可变区的氨基酸序列；B表示重链可变区的氨基酸序列。
[0042] 由表2可知，在12个克隆中未发现重复scFv序列，表明原始库具有高度的多样 性。
[0043] 原始库噬菌体加入500mL BLT5403宿主菌进行扩增，获得1代噬菌体扩增 库，同样进行噬斑测定确定1代扩增库的大小。结果显示，1代噬菌体扩增库库容达到 1. 12 X IO11PFlVmL0
[0044] 实施例5、生物淘选及阳性克隆鉴定
[0045] 根据的HCV E2区高保守aa412-423线性表位（QLINTNGSWHIN)，人工合成生物素标 记的合成肽 QLINTNGSWHINGSGK-biotin (由 Shanghai Sangon 合成），2mg 合成肽加入 ImL 含10 μ L冰酸的PBS中，配成浓度为2mg/mL的贮存液。连接合成肽与磁珠，取5mg (500 μ L) Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads (Invitrogen)加人 10 μ L 2mg/mL 的合成 肽，4°C转动孵育16小时，清洗后悬浮于ImL PBS中，4°C保存备用。为排除可能与Dynabeads M-280 非特异性结合的·菌体，在 2mL PTM(PBS+l%Tween_20+2%nonfat dry milkpowder) 中加入200 μ L噬菌体（2 X lO'fu)，2mg (100 μ L) Dynabeads M-280,室温转动孵育2小时， 磁力架吸附磁珠，吸取上清备用。100 μ L合成肽结合磁珠加入ImL PTM，室温封闭1小时， 然后加入ImL经Dynabeads M-280预处理的噬菌体，室温2小时，接着I. 5mL PBST清洗1 次，1.5mL PBS清洗3次，最后磁珠结合的噬菌体悬浮于100 μ L PBS中，其中50 μ L加入 1 % SDS，从磁珠上洗脱噬菌体，做噬斑检测，确定噬菌体产出量，另50 μ L直接接种于4mL BLT5403菌液中，扩增噬菌体，用于下一轮淘选。
[0046] 阳性克隆鉴定用含5 μ g/mL Neutravidin(invitrogen)的碳酸盐缓冲液（pH = 9. 7)包被Maxisorp Plates(Nunc)酶标板，洗板后加入1 μ g/mL生物素标记的合成多肽，室 温1小时孵育，让合成肽与包被的亲和素结合，PBST洗板3次除去未结合多肽，再加入PTM 室温封闭1小时，然后分别加入单个噬斑扩增的克隆噬菌体，室温2小时，PBST清洗3次， 加入 1:5000 稀释的酶标二抗?7* lag、?· Antibody HRP Conjugate (Novagen)，室温 1 小时孵 育，PBST清洗3次，每孔加入100 μ L TMB底物显色，用2mol硫酸终止反应后450nm波长读 取OD值。每个克隆做复孔检测，同时每个检测克隆各配置一个未加合成肽的阴性对照孔， 另外用碳酸盐缓冲液代替亲和素溶液作为空白对照。每轮淘洗后随机挑选噬斑进行检测， 以确定特异性结合多肽的噬菌体展示scFv的富集程度，并按OD值S/N > 10倍标准，选出 阳性克隆做进一步序列分析。筛选和鉴定结果如图2和表3所示。
[0047] 表3、噬菌体库的生物淘选及阳性克隆的富集
[0050] 结果显示，经过4轮淘洗，从第1轮到第4轮，产出相对于投入的比例逐轮增大， ELISA检测阳性率从第1轮未检出阳性克隆上升到第4轮的35. 46%，4轮检测结果对比图 更能明显看出增加趋势，特异性结合HCV E2区高保守表位噬菌体展示抗体得了明显的富 集。
[0051] 实施例6、序列分析
[0052] 各取2 yL阳性克隆噬菌体溶液加入100 yLlOmol EDTA液中，65°C 5分钟，离心后 取2 μ L上清，用T7噬菌体上，下游测序引物及Q5高保真聚合酶进行PCR，PCR产物纯化后 进行DNA序列分析（shanghai，sangon)。核酸序列资料用kabat编号分析scFv重链及轻链 的框架区（framework region，FR)和互补决定区（complementarity determining region, ⑶R)，并与已发表的AP33等抗-HCV广泛结合抗体⑶Rs区进行比对。结果显示，从第3,4 轮淘选的100个阳性克隆序列重复度非常高。从中选出强阳性的R4-85(s/n = 24)克隆， R4-85重链氨基酸序列如SEQ ID NO. 38所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO. 39所示，属于 λ家族。与已报导的AP33(鼠源性）、3/11(鼠源性）、HCV1(人源性）和Hc33.1(人源性） 等抗HCV E2区aa412-423线性表位的广泛结合性抗体进行CDR区氨基酸序列比对发现，不 同来源的抗体CDRs氨基酸序列虽然差异明显，特别是通常对抗体亲和力影响最大的重链 CDR3,氨基酸个数从3到18不等，但是在多个氨基酸位点存在明显的保守性，如图3所示。 这些在多个不同来源的抗-HCV广泛结合抗体中均高度保守的位点可能就是与CD81受体结 合的关键氨基酸位点。
[0053] 从上述研究可以得出，本发明从39人份包含中国主要HCV流行亚型（lb、2a、3a、 3b、6a型）抗HCV抗体阳性患者血清中抽提mRNA，逆转录和PCR扩增IgG、IgM抗体重链及 轻链可变区基因，连接噬菌体载体，成功构建了高容量的中国地区抗多亚型HCV scFv T7噬 菌体展示库，并淘选出与HCV E2高保守线性表位（QLINTNGSWHIN)高度特异性结合的抗体 基因 R4-85。因此，本发明成功的构建了抗-HCV多基因亚型T7噬菌体展示库，并从中成功 的淘选出了与HCV E2区aa412~423高保守线性表位QLINTNGSWHIN高度特异性结合的 scFv抗体，该表位在各HCV亚型中高度保守，是HCV与CD81的结合位点。因而，用该表位淘 选出的抗体对各亚型HCV具有广泛的结合能力。R4-85抗体在HCV诊断、治疗及疫苗研发等 领域具有很好的应用价值。
[0054] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85,其特征在于：所述抗体基因R4-85的重链氨基酸 序列如SEQ ID NO. 38所示或SEQ ID NO. 38所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨 基酸并具有相同活性的氨基酸序列；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO. 39所示或SEQ ID NO. 39 所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85,其特征在于：所述抗体基 因R4-85的重链和轻链由（G4S)3连接肽连接。3. 根据权利要求2所述的抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85,其特征在于：所述（G4S)3 连接肽的基因序列如SEQIDNO. 40所示。4. 由权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85编码的抗体。5. 根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述抗体为单链抗体、包括两条重链和两 条轻链的单体分子或由单体分子聚合成的多聚体。6. 含有权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的重组载体。7. 含有权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85的噬菌体。8. 权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备HCV诊断的试 剂中的应用。9. 权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备预防HCV感染 的疫苗中的应用。10. 权利要求1~3任一项所述抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85在制备治疗HCV感 染的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了抗多亚基因型HCV抗体基因R4-85，其重链氨基酸序列如SEQ？ID？NO.38所示，轻链氨基酸序列如SEQ？ID？NO.39所示，该抗体基因是用各亚型HCV中均高度保守的E2区aa412-423线性表位(HCV？CD81受体结合表位)合成肽从自主构建的抗-HCV？scFv抗体库中淘选获得；抗体库来自39份抗HCV抗体阳性的中国患者外周血样本，患者所感染的HCV涵盖中国主要HCV流行亚型，因此R4-85是中国特有的具有广泛结合特性的抗-HCV抗体，对我国在HCV诊断、治疗及疫苗研发等领域具有很好的应用价值。
【IPC分类】C12N7/01, A61K39/42, A61P31/14, C12N15/13, G01N33/569, C07K16/10
【公开号】CN105177017
【申请号】
【发明人】兰林, 崔传佳, 朱研, 胡亚君, 毛青
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月30日