抗多亚基因型hcv抗体基因r4-85及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85,还涉及该 抗体基因的应用。
【背景技术】
[0002] 迄今为止，全球约有1亿7千万丙型肝炎病毒（hepatits C virus，HCV)感染者， 占世界人口总数的3 %。WHO估计全球HCV感染新发病例以每年3至4百万的速度递增。 HCV主要经血行传播，感染后慢性化比例高达80%，是导致肝硬化、肝癌的重要原因。HCV属 黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链RNA病毒。HCV基因组高度变异，根据基因组的异质 性，共分为7个基因型近100种亚型。在全球，HCV感染具有明显的人种及地理分布差异性， 如：世界主要流行的HCV亚型是1&、11^、2&、213、3&型，而中国主要流行亚型为113、2 &、3&、313、 6a型。HCV还以准种形式存在于患者体内（即一组遗传学上密切相关又各不相同的病毒株 存在于宿主体内）。HCV所具有的这些特性，给HCV的诊断、治疗及预防都带来了及大的因 难。到目前为止，在诊断上尚无各亚型通用的病毒抗原检测试剂。在治疗上，聚乙二醇干扰 素联合利巴韦林的抗病毒方案使应答率升高，但存在明显的副作用，最近开发的HCV特异 性直接抗病毒药物则因为价格昂贵，限制了其广泛应用。在预防方面，也未开发出安全而有 效的HCV疫苗。
[0003] 2001 年 Ania Owsianka 首次发现在 HCV E2 N-末端（aa412-423)存在一个在 各亚型HCV中均高度保守的线性表位，并且随后的研究证实该表位是HCV受体CD81的结 合表位。与该表位特异性结合的抗体与各亚型HCV具有广泛的结合特性和中和能力，如： AP33 (mouse)、3/11 (Rat)、HCVl (human)、Hc33. I (human)等。进一步研究还发现这类抗-HCV 广泛性结合抗体在人肝嵌合鼠模型中不仅可以预防HCV感染，而且还可以治疗已经建立的 HCV感染，这对于预防肝移植术后高达80%的HCV再感染及治疗全球1. 7亿HCV已感染者 具有重大的现实意义，这类广泛结合抗体也为HCV疫苗的研究奠定了重要的基础。但是，已 报道的广泛交叉结合抗体并非都对HCV所有基因型具有中和作用，且针对不同基因型的中 和能力存在差异。故分离到全球通用的广泛结合性抗-HCV抗体可能十分困难，因此从中国 HCV感染人群中分离出的广泛结合性抗-HCV抗体可能更匹配中国流行的HCV亚型，也更适 合应用于我国的HCV诊断、治疗及疫苗研究等领域。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85 ;本发明 的目的之二在于提供由所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85编码的抗体；本发明的目的 之三在于提供含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85的重组载体；本发明的目的之四 在于提供含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85的噬菌体；本发明的目的之五在于提 供抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85在制备HCV诊断的试剂中的应用；本发明的目的之六 在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85在制备预防HCV感染的疫苗中的应用；本发明 的目的之七在于提供抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85在制备治疗HCV感染的药物中的应 用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85,所述抗体基因 R4-85的重链氨基酸序列如 SEQ ID NO. 38所示或SEQ ID NO. 38所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸并具 有相同活性的氨基酸序列；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO. 39所示或SEQ ID NO. 39所示氨 基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸并具有相同活性的氨基酸序列，其抗多亚基因 型HCV抗体基因 R4-85的构建过程如图4所示。
[0007] 优选的，所述抗体基因 R4-85的重链和轻链由（G4S)3连接肽连接。本发明中（G4S) 3连接肽的核苷酸序列如SEQIDN0·40所示，具体序列为：5'-ggtggaggcggttcaggcggaggtg gctctggcggtggcggatcg-3,。
[0008] 2、由所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85编码的抗体。优选的，所述抗体为单 链抗体、包括两条重链和两条轻链的单体分子或由单体分子聚合成的多聚体。
[0009] 3、含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85的重组载体。
[0010] 4、含有所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85的噬菌体。
[0011] 5、所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85在制备HCV诊断的试剂中的应用。
[0012] 6、所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85在制备预防HCV感染的疫苗中的应用。
[0013] 7、所述抗多亚基因型HCV抗体基因 R4-85在制备治疗HCV感染的药物中的应用。
[0014] 本发明的有益效果在于：本发明通过提取39例HCV感染者（涵盖中国地区主 要HCV流行亚型）的外周血白细胞mRNA，并采用T7噬菌体展示技术系统，成功构建了足 够大的抗多亚型HCV scFv噬菌体展示库，原始库及扩增库的库容分别为3. 6X IO7PFU及 I. 12X10nPFU/mL，通过对原始库中随机挑选的12个scFv克隆进行氨基酸序列分析，发 现两两之间均不相同，表明该噬菌体展示抗体库具有足够大的多样性，最后通过HCV E2区 aa412~423线性表位肽QLINTNGSWHIN进行淘选，分离得到与这个在各亚型HCV E2区均高 度保守的线性表位高特异性结合的R4-85scFV抗体基因（s/n = 24)。研究已经证实，HCV E2区aa412~423线性表位在各HCV亚型中均高度保守并且是HCV进入肝细胞的重要受 体CD81的结合位点，与此表位特异性结合的抗体对各亚型HCV具有广泛结合特性及中和能 力，对HCV诊断、治疗及疫苗研发具有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0016] 图1为人源性HCV scFv噬菌体展示库的构建（A :丙型肝炎患者外周血来源的 IgG、IgM重链及轻链可变区扩增条带，M代表DNA Marker ;B :针对低拷贝或单拷贝抗体基 因采用半巢式PCR进行第一轮扩增的目的条带，1-5分别代表以下上游引物：HuVH2aSS， HuVH6aSS，HuV κ 5aSS，HuV κ 6aSS，HuV λ 5SS ;C :采用重叠延伸PCR法连接重链与轻链可变 区基因的扩增产物，1 代表 VL κ -linker-VH scFv ;2 代表 VL λ -linker-VH scFv)。
[0017] 图2为每轮生物淘选后噬菌体克隆与HCV E2区aa412_423序列结合活性的对比 结果，采用ELISA方法检测克隆的结合特性，每轮淘选均设阴性对照，无游离肽段被亲和素 捕获。
[0018] 图3为淘选的R4-85阳性克隆与特异性识别E2蛋白aa412-423序列的其他中和 抗体的CDRs区比对（★表示该位点氨基酸在所有序列中相同，#表示该位点氨基酸相同的 序列数彡3)。
[0019] 图4为HCV scFv抗体构建流程图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 本发明实施例的研究对象如下：慢性HCV感染者及其血清样本均来自西南医院感 染科门诊患者。总共39人份抗-HCV阳性患者抗凝外周血，每份3mL。包括中国主要流行 HCV亚型：Ib型7例，2a型2例，3a型5例，3b型5例，6a型4例，基因型不确定16例（经 抗病毒治疗，HCV RNA已阴转）。新鲜采集的患者外周抗凝血立即与33mL RNA/DNA固定剂 (RNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone Marrow) (Roche)混合，_2(TC保存备 用。
[0022] 实施例1、引物设计
[0023] 根据John McCafferty的报道设计人IgG、IgM重链恒定区及κ、λ轻链恒 定区mRNA基因特异性逆转录引物，以及重链、轻链可变区PCR扩增引物（McCafferty ],Griffiths Ad Fau-ffinter G? Winter G Fau-Chiswell DJ? Chiswell DJ.Phage antibodies ：filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 1990 ； 348(6301) :552-4.)。为了方便插入T7噬菌体载体，在轻链可变区（VL)正向引物5'端 及重链可变区（VH)反向引物5'端分别加上EcoR I及Hind III酶切位点。为了产生 VL-Iinker-VH基因片段，采用重叠延伸PCR的方式连接PCR扩增的VL和VH片段，并在VL 反向引物5'端及VH正向引物5'端分别加上彼此反向重叠互补的（G4S)3连接肽编码序列。 引物scFvSS和scFvAS用于最后生成完整的scFv基因片段，所有引物序列如表1所示。
[0024] 表1、人源性抗多亚基因型HCV scFv噬菌体展示库构建所用引物
[0025] CN 105177017 A 说明书 4/10 页
CN 105177017 A 说明书 6/10 页
[0028] 实施例2、mRNA抽提及cDNA合成
[0029] 联合 RNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone Marrow(Roche)和 mRNA isolation kit for blood/bone marrow(Roche)，用磁珠法直接从外周血白细胞中分离提 取mRNA，按说明书进行操作，测定提取的mRNA浓度及A260/A280值。结果显示，每毫升患者 抗凝外周血细胞中平均获取130ng mRNA，A260/A280值为1. 90~2. 00,表明分离提取mRNA 可以用于建库，然后_80°C保存备用。各取用50ng从所有样本提取的mRNA做模板，分别用 人IgG、IgM重链恒定区，κ、λ轻链恒定区mRNA基因特异性逆转录引物，ProtoSeript? II First Strand cDNA Synthesis Kit(NEB)合成 cDNA，合并 cDNA，_20°C保存备用。
[0030] 实施例3、单链可变区片段（scFv)扩增
[0031] PCR扩增重链、轻链可变区基因，具体操作方法如下：等摩尔浓度分别预混重链及 κ、λ轻链可变区反向引物，终浓度10 μ M。在50 μ L PCR体积中，各包含单条上游引物及 预混反向引物各 25pmoL，cDNA 2 μ L，5 X Reaction Buffer 10 μ L，5 XHigh GC Enhancer 10 μL，IOmmol dNTP I μ L，Q51丨' High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)I 单位。反应 条件：98 °C预变性30秒后，98 °C变性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，共25个循 环；最后72°C后延伸2分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche)纯化PCR，电泳结果如图1中A所示。结果显示，单条上游引物 与混合的下游引物能有效的扩增出除低拷贝和单拷贝基因外的所有VH及VL。
[0032] 对扩增效果