8a(+)表达载体酶切后的大片段，将小片段和大片段连接后转化到大肠杆菌中， 挑选阳性克隆菌株，获得含有柞蚕Yippee基因的重组载体YP-Pet_28a+。
[0032] 2. 3Yippee蛋白的诱导表达、纯化及Western blot检测
[0033] 将5 μ L步骤2. 2的含有YP-Pet_28a+重组载体的大肠杆菌菌液接种到含Kan的 5mL的LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜，获得活化菌液，再取2. 5mL活化菌液至250mL 含Kan的LB液体培养基中，37°C，200r/min震荡培养，当0D600 = 0. 6左右时，加入终浓度为 0.1禮的1?了6,25°(：，12(^/1^11，继续4°(：震荡培养1011进行诱导表达，然后1200(^/1^11，离 心 15min 收集菌体，用 PBS 清洗两遍。用 IOmL 的 Lysis Buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole，pH 8. 0)悬浮菌体沉淀，吹打均勾，使菌体彻底悬浮，冰上超声破碎30min。 破碎液 12000r/min，离心 20min，取上清，使用 Qiagen Ni-NTA Agarose column 填料（银 柱）进行纯化获得重组蛋白，分别用聚丙烯酰胺电泳和Western blot方法（湿转法）检测 重组蛋白，获得如图2所示的结果。
[0034] 图2的电泳结果和Western blot结果显示重组蛋白的单一性较好，表明已经成功 诱导表达并纯化出Yippee重组蛋白，并可以用于多克隆抗体的制备。
[0035] 2. 4多克隆抗体的制备
[0036] 以纯化的重组蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔。采用皮下多点注射的方式，每两周 免疫一次。最后对白兔采用心脏采血，收集血清即为兔抗柞蚕Yippee多克隆抗体，分装保 存于-80°C备用。
[0037] 试验例1不同病原微生物刺激下Yippee基因核酸水平表达实验
[0038] 取五龄第3天的柞蚕幼虫进行免疫刺激处理，具体为：利用微量注射器分别将大 肠杆菌（E. coli DH5 α，10 μ 1，IO6个细胞 / 头）、白僵菌（B. bassiana，10 μ 1，10 6个孢子 / 头）、藤黄微球菌（M. L，10 μ 1，IO6个细胞/头）和核型多角体病毒（NPV，10 μ 1，10 6个多角 体/头）注射到五龄第3天的柞蚕幼虫体内，注射完成后用凡士林涂抹表皮。柞蚕幼虫在 注射1. 5、3、6、12、24和48h后分别收集脂肪体和血淋巴。
[0039] 采用Trizol法分别提取上述注射1. 5、3、6、12、24和48h后收集的脂肪体和血淋 巴，逆转录后得到cDNA，使用微量定量仪将cDNA浓度定量至200ng/ μ 1。将已定量的cDNA 作为模板，采用qRT-PCR的方法分别得到柞蚕在大肠杆菌、白僵菌、藤黄微球菌和核型多角 体病毒刺激下经过不同时间Yippee基因在核酸水平上的表达变化，其中：
[0040] qRT-PCR扩增引物为：
[0041] SEQ ID NO. 4 :上游引物 Fl :TGGCAGAGCTTCTTGTTCCATAAA
[0042] SEQ ID NO. 5 :下游引物 Rl :TAAACCCAGCCGAGCTTAGTACCGC ;
[0043] qRT-PCR扩增反应条件为：95°C预变性4min ;95°C变性5s，58°C退火15s，72°C延 伸15s，共计39个循环，72°C延伸5min。
[0044] qRT-PCR结果如图3所示，图3中可以看出，在不同微生物刺激下，Yippee基因 mRNA的表达均显著上调，说明Yippee基因参与柞蚕的免疫应答反应。
[0045] 试验例2Western blot法检测Yippee基因蛋白水平上的表达模式
[0046] 使用动物组织蛋白裂解液（生工C500028)分别提取试验例1收集的脂肪体和血 淋巴中的总蛋白，然后采用BCA蛋白定量试剂盒将蛋白终浓度稀释至3mg/ml。-80°C存放， 用于Western blot检测。将已定量的蛋白作为模板，采用Western blot的方法（湿转 法）分别得到柞蚕在大肠杆菌、白僵菌、藤黄微球菌和核型多角体病毒刺激下经过不同时 间Yippee基因在蛋白水平上的表达变化。
[0047] Western blot结果如图4所示，图4中可以看出，在不同微生物刺激下，Yippee蛋 白的表达随着Yippee基因 mRNA水平变化而变化，但是有明显的滞后性，并在mRNA含量降 低后也迅速降低到一个微量的水平，进一步证明了 Yippee蛋白是因为受到微生物刺激而 产生的应激产物。
【主权项】
1?一种柞蚕Yippee基因，其特征在于，该Yippee基因具有如SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列，或具有与SEQIDNO. 1所示序列互补的核苷酸序列。2. -种如权利要求1所述的柞蚕Yippee基因在参与柞蚕免疫应答反应中的应用。3. -种兔抗柞蚕Yippee多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将如权利要求1所述的柞蚕Yippee基因导入原核表达载体上，获得重组载体； (2) 将步骤（1)的重组载体转化至原核表达系统中进行蛋白诱导表达，然后分离纯化 蛋白，获得重组蛋白； (3) 将步骤（3)的重组蛋白注射大白兔，收集兔血清，获得所述兔抗柞蚕Yippee多克隆 抗体。4. 根据权利要求3所述的一种兔抗柞蚕Yippee多克隆抗体的制备方法，其特征在于， 所述步骤（1)的原核表达载体为Pet_28a+表达载体，所述步骤（2)的原核表达系统为大肠 杆菌表达系统。5. 根据权利要求3所述的一种兔抗柞蚕Yippee多克隆抗体的制备方法，其特征在于， 所述步骤（2)中，分离纯化蛋白的方法为镍柱纯化。
【专利摘要】本发明公开了一种柞蚕Yippee基因及其多克隆抗体的制备方法和应用，该柞蚕Yippee基因具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ？ID？NO.1所示序列互补的核苷酸序列；该多克隆抗体的制备方法为：将所述柞蚕Yippee基因进行原核表达获得重组蛋白，将重组蛋白注射大白兔，并收集兔血清，获得所述多克隆抗体。本发明的柞蚕Yippee基因为一种新的Yippee基因，其直接参与柞蚕的免疫应答反应，对于提高柞蚕自身免疫能力从而抵抗病原微生物的侵染，提高蚕丝产量，减少损失等具有重要意义。该基因对于推进鳞翅目其他昆虫相关研究也具有重要意义，也可为鳞翅目害虫的防治提供借鉴。
【IPC分类】C12R1/19, C12N15/70, C07K16/18, C12N15/12
【公开号】CN105177015
【申请号】
【发明人】刘朝良, 孙钰, 朱保建, 王磊, 魏国清, 钱岑, 戴立上, 孙誉轩
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月2日