一种柞蚕Yippee基因及其多克隆抗体的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种柞蚕Yippee基因及其多 克隆抗体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 柞蚕属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属的野生絹丝昆虫其茧丝的产量仅次于家蚕，主 要分布区域分别在中国、印度和韩国，其主要价值体现在可以作为纺织工业原料利用，而且 具备很高的药用和食用等经济价值，可用于补充人体所必需的氨基酸，具有可大规模饲养 以及个体大等优点，可以作为生物反应器生产医用药物和有用蛋白。因此，对其开展功能基 因的研究，对于保护和开发柞蚕的基因资源具有重要意义。
[0003] 当前，柞蚕产业发展的重要课题包括利用生物技术手段提高柞蚕产量、茧丝品质 以及开发一些高附加值的柞蚕生物新产品，而柞蚕功能基因的克隆和鉴定则是柞蚕生物技 术的重要研究内容，是柞蚕种质资源的改良和利用以及柞蚕生物反应器研究的基础。对柞 蚕的功能基因研究从上世纪90年代开始，已经取得一些进展，但相比于家蚕的研究进展两 者仍差距较大。随着柞蚕病虫害对农药的抗性、适应性增强，在生产上就迫切需要应用新的 技术来有效控制其危害。因此柞蚕研究的重要方向是针对柞蚕主要病虫害开展新药剂以及 综合防控技术的研究。
[0004] 目前关于柞蚕免疫机理研究报道很少，这些病原导致的病害每年给养蚕农户带来 了很大的经济损失，因此通过提高其自身的免疫功能来提高柞蚕的生产产量将是一件十分 有意义的工作。柞蚕作为一种重要的经济昆虫，被病源物侵染的相关研究不多，为了更好地 了解病原物感染后柞蚕的应答机制，也为培育高抗病性柞蚕品种提供理论依据。因此，研究 对柞蚕先天免疫防御相关基因的研究对于提高柞蚕蚕抗病能力具有重要的理论意义。蚕病 在蚕业生产成为一大害，每年造成的损失巨大。致病微生物给柞蚕的生长发育形成了巨大 的威胁，也给柞蚕的养殖带来了很大的威胁，主要原因是首先病原微生物本身的致病性强 致死率高，其次柞蚕本身作为鳞翅目昆虫只有先天免疫系统而没有获得性免疫系统，那么 怎样提高柞蚕自身免疫能力从而抵抗病原微生物的侵染，提高蚕丝产量，减少损失，就越来 越成为大家研究的重点。柞蚕免疫相关基因的研究对于推进鳞翅目其他昆虫相关研究也具 有重要意义，也可为鳞翅目害虫的防治提供借鉴。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种柞蚕Yippee基因及其多克 隆抗体的制备方法和应用，以提供一种新的Yippee基因。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明提供了一种柞蚕Yippee基因，该Yippee基因具有如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO. 1所示序列互补的核苷酸序列，该Yippee基因是从柞蚕 中克隆获得的，也可通过人工合成方式获得。
[0008] 本发明还提供了上述柞蚕Yippee基因在参与柞蚕免疫应答反应中的应用。
[0009] 本发明还提供了一种兔抗柞蚕Yippee多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)将上述柞蚕Yippee基因导入原核表达载体上，获得重组载体；
[0011] (2)将步骤（1)的重组载体转化至原核表达系统中进行蛋白诱导表达，然后分离 纯化蛋白，获得重组蛋白；
[0012] (3)将步骤（3)的重组蛋白注射大白兔，收集兔血清，获得所述兔抗柞蚕Yippee多 克隆抗体。
[0013] 进一步优选地，所述步骤（1)的原核表达载体为Pet_28a+表达载体，所述步骤（2) 的原核表达系统为大肠杆菌表达系统。
[0014] 进一步优选地，所述步骤（2)中，分离纯化蛋白的方法为镍柱纯化。
[0015] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种柞蚕Yippee基因及其多 克隆抗体的制备方法和应用，该柞蚕Yippee基因为一种新的Yippee基因，其直接参与柞蚕 的免疫应答反应，对于提高柞蚕自身免疫能力从而抵抗病原微生物的侵染，提高蚕丝产量， 减少损失等具有重要意义。该基因对于推进鳞翅目其他昆虫相关研究也具有重要意义，也 可为鳞翅目害虫的防治提供借鉴。
【附图说明】
[0016] 图1为Yippee基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；
[0017] 图2为纯化的重组蛋白检测结果，其中：A为聚丙烯酰胺电泳检测结果图，B为 Western blot 鉴定图；
[0018] 图3为不同微生物刺激后Yippee基因表达水平变化qRT-PCR检测图；
[0019] 图4为不同微生物刺激后Yippee蛋白表达水平变化Western Blot检测图。
【具体实施方式】 [0020] 实施例1
[0021] 1、材料
[0022] 本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用 的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0023] 2、方法
[0024] 2. 1柞蚕Yippee基因的获得
[0025] 采用Trizol法提取柞蚕总RNA，以柞蚕总RNA为模板进行反转录，获得柞蚕cDNA。 根据SEQ ID NO. 1所示的柞蚕Yippee基因序列，设计特异性扩增引物如下，其中，上游引物 Fl包含XhoI酶切位点，下游引物Rl包含BamHI酶切位点：
[0026] SEQ ID NO. 2 :上游引物 Fl ：CGCCTCGAGGTATACTAGGTTAAC
[0027] SEQ ID NO. 3 :下游引物 Rl ：GGCGGATCCATGGGAAGAATATTT
[0028] 以柞蚕cDNA为模板，利用上述特异性扩增引物，在高保真酶Ex Taq(TAKARA公司 购买）聚合酶作用下进行PCR扩增，扩增反应条件为：95°C预变性3min ;95°C变性30s，53°C 退火40s，72°C延伸45s，共计35个循环，72°C总延伸10min，4°C保存。
[0029] PCR扩增产物经L 0% (质量）琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为360bp左右的条 带（如图1所示），使用Axygen公司DNA纯化回收试剂盒进行进行纯化回收，获得目的片 段，将目的片段加载到PMD19-T载体上，获得YP-pMD-19重组载体，并转化到大肠杆菌感受 态Trans 5 α细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆菌株，对检测结果初步判定正确的阳性克 隆菌株送往上海生工测序，测序结果与预测结果一致。
[0030] 2. 2YP-Pet_28a+重组载体的构建
[0031] 使用Axygen公司AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取上述步骤2. 1的阳性克隆菌株 的质粒，获得YP-pMD-19重组载体，将YP-pMD-19重组载体与pET-28a(+)表达载体分别用 Xho I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，切胶回收YP-pMD-19重组载体双酶切后的小片 段和pET-2