离心1分钟，管底溶液即为纯化过的核酸适配体的PCR产物。
[0017] 实施例2:核酸适配体的克隆和测序以及单链DNA二级结构的预测 一、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备 1、 挑取单个DH5 a菌落，接种于3 mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜，次 日取上述菌液按比例1:100再接种于50 mL液体LB培养基中，37°C振荡2小时；当0D600 值达到0. 35时，收获细菌培养物； 2、 将细菌培养物转移到一个50 mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培养物 冷却； 3、 于4°C下4000 rpm离心10 min，弃去培养液，并将管倒置I min以使残留的培养液 流尽； 4、 各加150 μ L冰预冷的0.1 mM CaCl2溶液，合并两管，冰浴10 min ; 5、 于4°C下4000 rpm离心10 min，弃去上清液，并将管倒置I min以使残留的液体流 尽； 6、 先加入800 μ L冰预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞，再加入25 μ L预冷的75%的 甘油，之后于-80 °C贮存备用。
[0018] 二、连接及连接产物的转化 1、 在微量离心管中加入0.5 yL Takara pMD19_T simple载体、4.5 yL核酸适配体 PCR产物及5 μ L的连接酶缓冲混合物； 2、 16°C反应3小时； 3、 全量（10 yL)加入至100 yLDH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟； 4、 42 °C加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟； 5、 加入37°C温浴过的LB培养基890 μ L，37°C缓慢振荡培养60分钟； 6、 取200以1^涂布于含有乂-6&1、1?16、氨苄青霉素的1^培养基上，37°(：培养16小时 以形成单菌落。
[0019] 三、核酸适配体的克隆筛选和测序以及单链DNA二级结构预测 挑取上述白色的单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C缓慢振荡培养4小时，进 行PCR扩增；扩增引物及扩增条件同前述核酸适配体的扩增条件。将经PCR确证的阳性克 隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems 3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷 酸序列的测定；结构表明，与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体(命名为H06)其序列自 5'端至3'端为： TGACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGGATGCACGGGAGATGGACGAAT ATCGTCTAGCA 与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体Η06的序列长度：84个碱基，序列类型：核 酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：ssDNA。
[0020] 通过MFOLD软件设置温度为26 °C、Na+浓度为150 mM，Mg 2+浓度为I mM (http://mfold.rna· albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)和 QGRS 映射（http:// bioinformatics, ramapo. edu/QGRS/analyze. php)对与α -鶴膏毒肽特异性结合的核酸适 配体Η06单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，适配体含有突出的环和茎，存在G-四 链体结构，其吉布斯自由能DG=-15. 36,该结构具有较高的稳定性。
[0021] 实施例3:圆二色谱法对K +浓度与核酸适配体H06的关系的探究 1、 将适配体用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7. 2)稀释至20 μ M后，于94°C变性 0· 5 min以0· 5°C /min的速度冷却至25°C ; 2、 用含有不同浓度（0、5、10、20、50 mM) KCl 的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7. 2)将 核酸适配体H06稀释至2. 5 μ M ; 3、 于25°C，220 - 340 nm波长处用圆二色谱仪进行检测（结果见图1)，结果显示在不同 浓度K+溶液中均有275nm处的峰值出现，说明核酸配体H06具有茎环结构和G-四链体结 构。
[0022] 实施例4:核酸适配体（H06)的特异性和对α -鹅膏毒肽的敏感性 一、核酸适配体Η06特异性检测 UELONA方法 在传统的ELISA方法的基础上加以改进，用筛选出来的适配体来代替抗体，采用生物 素-亲和素放大系统用以检测待测样品的一种方法。
[0023] (1)适配体-生物素的包被 筛选出来的特异性识别α -鹅膏毒肽的核酸适配体送到TaKaRa公司合成，得到用生物 素标记的适配体。使用时先短暂离心，使生物素标记的适配体聚集在试管底部。根据说明 书，用灭菌水或TE buffer (ρΗ7. 5-8. 0)充分溶解成存储溶液，一般浓度为10 4或10 5M,置 于-20°C保存。为避免反复冻融，可分装成小份。将生物素标记的适配体用IXPBS稀释到工 作浓度，每个孔加100 yL，用不干胶或封口膜密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h， 孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min， 每次都要在干净的吸水纸上拍干。
[0024] (2)加 α-鹅膏毒肽孵育 按核酸适配体结合缓冲液与α-鹅膏毒肽体积比1:1的比例加入到包被有生物素标 记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μ L，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育 1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干。（对照组则将α-鹅膏毒肽换成非靶标蛋白， 方法同上)。
[0025] (3)加酶结合物孵育 往每孔中加入100 μ L辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡 器上孵育I h，洗涤3次，每次2 min。
[0026] (4)显色 每孔加入TMB100 yL，于37°C避光显色10 min，拍照保存。
[0027] (5)终止 加25 μ L终止液（2 M硫酸)，并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处吸 光度值0D450。
[0028] 结果显示，适配体H06能够与α -鹅膏毒肽特异性的结合(结果见图2)，核酸适配 体Η06不与其他蛋白反应，能够快速检测到α -鹅膏毒肽。
[0029] 2、Dot Blot 方法 (1) 将5微升的α-鹅膏毒肽（40 ng/μ L)点至圆形NC膜（半径为0.25cm)中心，待 NC膜干燥后，置于2mL的冻存管，同时设立空白对照和阴性对照； (2) 加入100微升封闭液，与37°C孵育2h，用含0. 05% Tween-20的PBS溶液洗膜3次， 每次3min ; (3) 将制备好的标记有生物素的配体于95°C变性5min，迅速降至4°C，将适配体加到制 备好的NC膜上，37°C孵育2h后，用含0. 05% Tween-20的PBS溶液洗膜3次，每次3min ; (4) 将辣根过氧化物酶结合物加到NC膜上，37°C孵育Ih后，用含0. 05% Tween-20的 PBS溶液洗膜3次，每次3min ; (5) 加入TMB到NC膜，于37°C避光显色10 min，观察适配体与蘑菇毒素的结合情况，拍 照保存(结果见图3)，结果表明核酸适配体H06具有很高的特异性，能够快速检测到α -鹅 膏毒肽。
[0030] 二、核酸适配体Η06最佳浓度的检测 1、 将生物素标记的适配体用IX PBS稀释到不同的工作浓度，每个孔加100 μ L，用不 干胶或封口膜密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加 洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，每次都要在干净的吸水纸上拍 干； 2、 按适配体结合缓冲液与40 ng/ μ L的α -鹅膏毒肽溶液体积比1:1比例加入到包被 有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μ L，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振 荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤 3次，每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干； 3、 往每孔中加入100 μ L辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振 荡器上孵育I h，洗涤3次，每次2 min ; 4、 每孔加入TMBlOO μ L，于37°C避光显色10 min; 5、 加25 μ L终止液（2 M硫酸)，并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处 吸光度值OD450 ; 6、 结果表明，适配体H06的最佳浓度为80 nM (结果见图4)。
[0031] 三、核酸适配体H06对α -鹅膏毒肽的灵敏度的检测 1、 将生物素标记的适配体用IXPBS稀释到工作浓度，每个孔加100 μ L，用不干胶或 封口膜密封，于37°C、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液 200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，每次都要在干净的吸水纸上拍干； 2、 按适配体结合缓冲液与不同浓度的α -鹅膏毒肽溶液体积比1:1比例加入到包被有 生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μ L，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振荡 器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μ L，于水平摇床上振荡洗涤3 次，每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干； 3、 往每孔中加入100 μ L辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37°C、150 rpm振 荡器上孵育I h，洗涤3次，每次2 min ; 4、 每孔加入TMB100 μ L，于37°C避光显色10 min; 5、 加25 μ L终止液（2 M硫酸)，并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处 吸光度值0D450 ; 6、 结果表明，适配体H06能检测到蘑菇毒素 α-鹅膏毒肽的最低浓度为8 ng/yL (结 果见图5)。
【主权项】
1. 一种与a-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO:1 所示。2. 根据权利要求1所述核酸适配体，其特征在于：其二级结构具有突出的环和茎，存在 G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15. 36。3. 权利要求1所述核酸适配体在识别a-鹅膏毒肽或在制备检测a-鹅膏毒肽的试剂 盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合α-鹅膏毒肽的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15.36；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到α-鹅膏毒肽。
【IPC分类】C12N15/115, G01N33/68
【公开号】CN105177009
【申请号】
【发明人】韩芹芹, 乔璞, 宋玉竹, 张金阳, 陈强
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月10日