一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与α -鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技 术领域。
【背景技术】
[0002] 核酸适配体是一类能与靶分子特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子（DNAS RNA)，可通过SELE利记体育，从特定的寡核苷酸库中筛选得到。由于其具有靶分子范围广、分 子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和 疾病治疗等领域中具有重要的应用价值。
[0003] 鹅膏菌毒素（amanitin)是从毒蘑菇中分离出来的一种多肽类物质，其中以Ct-鹅 膏毒肽的毒性最强（α-amanitin)。人若误食含有α-鹅膏毒肽的鹅膏菌（Amanita)后， 轻者可产生腹泻、腹痛、呕吐，重者可出现幻觉、昏迷等多种症状，致死率较高。α-鹅膏毒 肽是从鹅膏菌中分离出来的一种八肽化合物，它是RNA聚合酶II的专一性抑制剂，能抑制 真核细胞RNA聚合酶II的活性，从而阻碍mRNA转录和蛋白质的合成，这也是引起鹅膏毒 素中毒，导致死亡的主要因素。因此，利用SELE利记体育筛选α-鹅膏毒肽的特异性核酸适配 体，进而及时、快速检测出食用野生菌中是否含有鹅膏毒素，对于降低误食蘑菇中毒及诊断 治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序 列如SEQ ID NO :1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链 状；预测的二级结构具有突出的环和莖，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15. 36。
[0005] 本发明另一目的是将与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体应用在识别α -鹅 膏毒肽或在制备检测α-鹅膏毒肽的试剂盒中。
[0006] 本发明的技术方案如下： 1、 α-鹅膏毒肽特异性核酸适配体（Η06)的筛选、克隆、分离和测序 采用SELE利记体育筛选出能够与α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体群体，设计引 物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA)进行验证，得 到适配体Η06,它能够高亲和力高特异性的结合α-鹅膏毒肽。配体接头引物序列为： Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC ;反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC ;Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进 行核苷酸序列测定，测序结果表明与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体（H06)由84个 核苷酸组成，其序列（5'端至3'端）为： TGACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGGATGCACGGGAGATGGACGAAT ATCGTCTAGCA ； 2、 核酸适配体（Η06)单链DNA二级结构表征 使用 MFOLD 软件（http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)对与 α -鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体H06单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其 二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-15. 36,显示该结构具 有较高的稳定性；其二级结构如下：
3、核酸适配体（H06)的特异性和对α -鹅膏毒肽的敏感性 根据核酸适配体Η06的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了 一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对Η06的特异性和其对α -鹅膏毒肽的敏 感性进行检测；结果显示，Η06具有很高的特异性，其能检测到蘑菇毒素 α-鹅膏毒肽的最 低浓度为8 ng/yL。
[0007] 本发明的意义在于： 利用SELE利记体育筛选出的配体H06能够高亲和力高特异性的识别并结合α -鹅膏毒 肽；核酸适配体Η06的鉴别对于食用野生菌中α-鹅膏毒肽的检测，进而降低α-鹅膏毒肽 对人体的侵害具有重要意义。
【附图说明】
[0008] 图1为本发明中⑶圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体H06的关系的分析； 图2为本发明中ELONA法对核酸适配体H06的特异性分析，图中：空白对照1为α -鹅 膏毒肽+脱脂奶；空白对照2为α -鹅膏毒肽+不含配体的生物素；阴性对照1为苏丹红+ 标记有生物素的配体Η06 ;阴性对照2为三聚氰胺+标记有生物素的配体Η06 ;阴性对照3 为草甘膦+标记有生物素的配体Η06 ;阴性对照4为瘦肉精+标记有生物素的配体Η06 ;阴 性对照5为乙型脑炎NSl蛋白+标记有生物素的配体Η06 ;阴性对照6为乙型脑炎core蛋 白+标记有生物素的配体H06 ; α -鹅膏毒肽为α -鹅膏毒肽40 ng/ μ L +标记有生物素的 配体Η06 ; 图3为本发明中Dot Blot法对核酸适配体Η06的特异性分析，图中：1 :空白对照 (α -鹅膏毒肽+脱脂奶）；2 :空白对照（α -鹅膏毒肽+不含配体的生物素）；3 :阴性对照 (苏丹红+标记有生物素的配体Η06) ;4 :阴性对照（三聚氰胺+标记有生物素的配体Η06); 5 :阴性对照(草甘膦+标记有生物素的配体Η06);6 :阴性对照(瘦肉精+标记有生物素的配 体Η06);7 :阴性对照（乙型脑炎NSl蛋白+标记有生物素的配体Η06);8 :阴性对照（乙型脑 炎core蛋白+标记有生物素的配体Η06);9 : α -鹅膏毒肽40 ng/ μ L +标记有生物素的配 体 Η06 ; 图4为本发明中ELONA法对核酸适配体Η06的最佳浓度的分析，图中：空白对照1 : α -鹅膏毒肽+脱脂奶；空白对照2 : α -鹅膏毒肽+不含配体的生物素；配体Η06 : α -鹅 膏毒肽+标记有生物素的配体Η06 ; 图5为本发明中ELONA法对α -鹳霄毒肽灵敏度的分析，图中：空白对照1 : α -鹳霄毒 肽+脱脂奶；配体Η06 : α -鹅膏毒肽+标记有生物素的配体Η06。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合附图和实施例来进一步说明本发明的实质性内容，实施例仅为了更好理 解本发明但不局限与本发明范围，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂 如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0010] 实施例1: α -鹅膏毒肽核酸适配体（Η06)的筛选 一、配基（α -鹅膏毒肽）与基质(琼脂糖凝胶6Β)的偶联 1、在3 mL蒸馏水中悬浮I g的冻干粉末琼脂糖凝胶6Β (I g冻干的粉末能够产生出 大约3. 0 mL的最终的基质体积）； 2、立即在烧结玻璃滤器中（多空度G3)用大约每克粉末200 mL的蒸馏水冲洗1小时； 3、 用6 mL的偶联缓冲溶液（0. 05 M，pH 9. 6的碳酸盐缓冲液)溶解6 g的配基，使其最 终浓度为I mg/mL，或者用脱盐柱将溶解的配基转移到偶联缓冲溶液中，调整水相的pH值； 4、 将基质与上述步骤3中的浓度为I mg/mL溶解好配基的缓冲溶液的比例调整为体积 比1:2,在25°C到40°C的水浴条件下，混合16 h，并且37°C摇床过夜； 5、 在40°C到50°C的条件下，用IM的氨基乙醇封闭过剩的基团，至少4 h或者过夜； 6、 用偶联缓冲液洗过剩的配基，4000 rpm离心2 min，吸取上清；用超纯水(每次7-8 mL)清洗3次；紧接着用0.1 M NaHCO3,0. 5 M NaCl，pH 8. 0的溶液清洗3-4次；然后用0. 1 M NaCl，0.1 M醋酸盐，pH 4. 0的溶液清洗3-4次；最后用质量百分比浓度为20%乙醇6 mL 保存，放置于4 °C冰箱，封口膜封口，竖直放置。
[0011] 二、核酸适配体文库（ssDNA)的PCR 采用TaKaRa公司合成的ssDNA适配体文库； 1、 94°C 预热 PCR 仪； 2、 将 3 yL ssDNA、30.6 yL 去离子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP 混合物(各2.5 μΜ)、2μL正向扩增引物、2 yL反向扩增引物以及0.4 yL Taq酶离心管 进行反应。正向扩增引物序列为5 ' - GACATATTCAGTCTGACAGC-3 '，反向扩增引物序列为 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0012] 3、在PCR仪中按以下程序扩增 (1) 预变性 94 0C 5分钟； (2) 40个循环 94 0C 45秒钟 58 0C 45秒钟 72 0C 30 秒钟； (3) 后扩增 72 0C 7分钟。
[0013] 三、配体库的纯化、上样及洗脱 1、配体库的纯化 (1) 核酸适配体文库PCR产物直接与胶回收试剂盒里的溶液按体积比1:1比例混合，进 行DNA片段回收； (2) DNA片段回收后，95°C水浴lOmin，冰浴IOmin ;经过此变性处理，使双链DNA变成单 链 DNA。
[0014] 2、亲和层析 (1) 用偶联缓冲液洗脱偶联过的基质：先吸取上层酒精，加偶联缓冲液至6 mL，混匀， 离心，弃去上清液，此步骤重复3次； (2) 将上述第1步中的单链DNA加入到偶联过的基质中，于37°C温育并40 rpm轻柔转 动2 h ; (3) 加入前述样品到层析柱中，用2-3柱体积的超纯水冲洗柱子； (4) 然后用3-4柱体积的洗脱缓冲液（0.1 M NaCl，0.1 M醋酸盐，pH 4.0)进行线性梯 度洗脱，收集洗脱组分； (5) 洗脱组分与胶溶液等体积混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
[0015] 四、PCR优化和大量扩增核酸适配体 以上述selex溶液作为模板，按如下步骤操作： 1、 94°C 预热 PCR 仪； 2、 将5 yL 模板、28.6 yL 去离子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP混 合物(各2.5uM)、2 yL正向扩增引物、2 yL反向扩增引物、0.4 yLTaq酶，于PCR离心 管中进行反应。正向扩增引物序列为5' -GACATATTCAGTCTGACAGC-3'，反向扩增引物序列 为 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0016] 3、在PCR仪中按以下程序扩增： (1) 预变性 94 °C 5分钟； (2) 37个循环： 94 0C 45秒钟 58 0C 45秒钟 72 0C 30 秒钟； (3) 后扩增 72 0C 7分钟； 4、循环结束后，将PCR产物用TIANGEN公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步 骤如下： (1) 将PCR产物与等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室 温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液； (2) 加入700 μL的漂洗液(含乙醇）于离心纯化柱中，12000 rpm离心1分钟，倒掉收 集管中的废液； (3) 重复步骤（2); (4) 12000 rpm 离心 3 分钟； (5) 将离心纯化柱置于新的离心管中； (6) 加入30 PL超纯水，在室温下静置5分钟； (7) 12000 rpm