] 2. 3. 3选择培养基
[0046] 将 10OmT, N6大量；IOmLN 6微量；lOmLVitamin，所述 IOmLVitamin 为 IL 加 0· Ig 肌 醇粉末；IOmLFe盐；600mg/L水解酪蛋白CH ;30g/L蔗糖；加 dd H2O定容到lOOOmL，用KOH 调pH值至5. 9,加3. 0g/L琼脂粉，加入2, 4-D储备溶液，煮沸，再分装到组培瓶中，所述组培 瓶为25mL/瓶，高压蒸汽灭菌；将培养基冷却到40°C~60°C，再加入5mL/L羧苄储备溶液、 lmL/L潮霉素储备溶液、lmL/L头孢储备溶液。在超净工作台上分装到组培瓶中。
[0047] 2. 3. 4分化培养基
[0048] 将 10OmT, MSmax ；IOmLMsmin ; IOmLFe 盐；1 OmT, Vitamin，所述 10mT, Vitamin 为 IL 加〇. Ig肌醇粉末；l〇〇〇mg/L水解酪蛋白CH ;30g/L蔗糖；2mL/L NAA储备溶液；2mL/L 6-BA 储备溶液；〇. 200uL/L KT储备溶液；200uL/L IAA储备溶液加入dd H20定容至1000 mL,用 KOH调pH值至6. 0,加3g/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌；待培养基冷却到40°C~60°C，加入5mL/ L羧苄储备溶液和2, 5mL/L潮霉素储备溶液，在超净工作台上分装到组培瓶中。
[0049] 2. 3. 5生根培养基
[0050] 将 50mlMSmax ；.SmTMsmiη ； 10mT, Fe 盐；lOmLVitamin，所述 10mT, Vitamin 为 IL 加 〇· Ig肌醇粉末；20g/L蔗糖加入dd H2O定容至700mL，用KOH调pH值至5.8 ;煮沸，加02ml/ LIBA储备溶液，再加入dd H2O定容至lOOOmL，倒入生根瓶。
[0051] 上述步骤所用到的一些热不稳定性化合物如抗生素、AS、6_BA及KT细菌滤器除菌 后于培养基温度降至50°C左右时加入。
[0052] 2. 3. 6培养基相关溶液的配制和抗生素溶液配制
[0053] A、Msmax 储备溶液（IOX):
[0055] 用CldH2O定容至lOOOmL，室温保存；
[0056] B、MSmin 储备溶液（100X):
[0059] Na2MoO4要单独溶解，再加入到混合液中，用ddH 20定容至lOOOmL，室温保存；
[0060] C、N6Hiax 储备溶液（10X):
[0062] 用ddH20定容至lOOOmL，室温保存；
[0063] D、N6min 储备溶液（100X):
[0065] 用CldH2O定容至lOOOmL，室温保存；
[0066] E、Fe2+-EDTA (100X):
[0068] 待两者全部溶化后，相混溶，70°C水浴中保温2h，用CldH2O定容至1000mL，4°C储 存；
[0069] F、Vitamin (100X):
[0071] 用 CldH2O 定容至 1000mL，4°C储存；
[0072] G、lmg/mL 的 2, 4-D 储备溶液：
[0073] 称取5. 61g 2, 4-D加入1.0 mL IN KOH，点振5min后加入IOmL H2O,再晃动直至 2, 4-D全部溶解，再用CldH2O定容至100mL，室温保存；
[0074] H、lmg/mL 的 6-BA 储备溶液：
[0075] 称取0· Ig 6-BA，加入1.0 mL IN Κ0Η，晃动直至6-BA全部溶解，用CldH2O定容至 IOOmL，室温保存；
[0076] I、lmg/mL 的 NAA 储备溶液：
[0077] 称取0.1 g NAA萘乙酸，加入1.0 mL IN Κ0Η，晃动直至NAA全部溶解，用CldH2O定容 至IOOmL，室温保存；
[0078] J、lmg/mL 的 IAA 储备溶液：
[0079] 称取0.1 g IAA吲哚乙酸，加入1.0 mL IN Κ0Η，晃动直至IAA全部溶解，用CldH2O定 容至 10OmT,；
[0080] K、抗生素储液配
[0082] 2· 4转基因水稻的鉴定
[0083] 2. 4. 1转基因水稻的PCR分子检测
[0084] 为了检测转基因水稻是否为阳性植株，以提取的转基因水稻总DNA为模板，用目 的基因 PZmD4启动子片段和植物表达载体上所含的潮霉素 Hyg基因和GUS基因为检测对 象，设计引物，扩增片段，用以初步鉴定转基因植株，图2为17棵转基因阳性植株的PCR检 测结果。
[0085] 用于检测⑶S基因的引物序列如下：
[0086] SEQ ID NO. 4 :引物 3(上游引物）：5' -GTGAATCCGCACCTCTGGCAAC-3'
[0087] SEQ ID NO. 5 :引物 4(下游引物）：5' -ATCGCCGCTTTGGACATACCAT-3'
[0088] PCR反应条件为：预变性：94°C IOmin ;变性：94°C 30s ;退火：60°C 45s ;延伸： 72°C lmin，34 个循环；总延伸：72°C lOmin。
[0089] 用于检测潮霉素抗性基因 Hyg的引物序列如下：
[0090] SEQ ID NO. 6 :引物 5(上游引物）：5' -TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3'
[0091] SEQ ID NO. 7 :引物 6(下游引物）：5' -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'
[0092] PCR反应条件为：预变性：94°C IOmin ;变性：94°C 30s ;退火：62°C 30s ;延伸： 72°C lmin，34 个循环；总延伸：72°C 10min。
[0093] 用于检测目的基因 PZmD4启动子片段的引物序列如SEQ ID NO. 2(引物1)和 SEQ ID NO. 3 (引物2)所示；PCR反应条件为：预变性：94°C IOmin ;变性：94°C IOs ;退火： 60°C 5s ;延伸：72°C lmin，33 个循环；总延伸：72°C 10min。
[0094] 2· 4· 2⑶S基因的组织化学染色
[0095] 分子检测结果初步鉴定为转基因植株后，分别对转PZmD4启动子植株不同时期不 同部位进行⑶S组织化学染色。具体操作步骤如下：
[0096] 步骤一：取转基因水稻不同时期不同的组织：将各部位放入试管中，加入适量的 ⑶S固定液，室温下温和摇动30~60min，用50nmol/L的磷酸钠缓冲液（pH7. 0)洗10~ 15min，重复几次，以除去组织中残留的固定液；
[0097] 步骤二：对染色液进行Imin中真空抽滤，将各组织置于⑶S染色液中保温4~ 12h ;结束后，将染色组织先置于75%乙醇漂洗脱色，再用50%和20%乙醇各侵泡20min以 上，直到材料呈白色；肉眼或显微镜下观察，组织上有蓝色小点即为⑶S表达部位。
[0098] ⑶S基因的组织化学染色结果如图3所示，其中：A为幼叶，B为幼茎，C为幼根，D 为成熟叶，E为成熟茎，F为成熟根，G为穗茎，H为颖壳，I为花药，J为蜡黄期种子，K为完 熟期种子，L为完熟期种子（剖面）。结果显示：PZmD4启动子能驱动GUS基因在完熟期种 子的种皮器官中表达，在其它组织中（A幼叶，B幼茎，C幼根，D成熟叶，E成熟茎，F成熟根， G穗茎，H颖壳，I花药，J蜡黄期种子）中不表达。从而证明了启动子PZmD4仅在水稻的种 皮中特异性表达。
【主权项】
1. 一种种皮特异性表达启动子，其特征在于，该启动子具有如SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列，或具有与SEQIDNO. 1所示序列互补的核苷酸序列。2. -种如权利要求1所述的种皮特异性表达启动子在驱动植物中目的基因在种皮中 特异性表达的应用。3. 根据权利要求2所述的一种种皮特异性表达启动子在驱动植物中目的基因在种皮 中特异性表达的应用，其特征在于，所述的植物包括水稻、玉米。4. 一种植物表达载体，其特征在于，该植物表达载体含有如权利要求1所述的种皮特 异性表达启动子。5. 根据权利要求4所述的一种植物表达载体，其特征在于，该植物表达载体利用所述 种皮特异性表达启动子替换双元表达载体PCAMBIA1301中的CaMV35S启动子构建获得。6. -种如权利要求5所述的植物表达载体在用于转基因植株筛选中的应用，其特征在 于，将待转的外源基因连接至所述植物表达载体的多克隆位点中，并导入植物细胞、组织或 器官，获得完熟期的再生植株种子，将完熟期的再生植株种子经⑶S组织化学染色，若种皮 上有蓝色小点，则该种子为转基因植株种子。7. -种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求1所述的种 皮特异性表达启动子，或含有如权利要求4、5任一所述的植物表达载体。8. 根据权利要求7所述的一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为 根癌农杆菌细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种种皮特异性表达启动子及其应用，属于植物基因工程技术领域，该启动子具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ？ID？NO.1所示序列互补的核苷酸序列。该种皮特异性表达启动子为一种新的启动子基因，其能够启动目的基因在植物的种皮上特异性表达，实现了外源基因在植物中的时空特异性表达；由于该启动子只能驱动下游目的基因在植物种皮中表达，从而避免该目的基因在植物其它组织中持续表达所带来的不利影响；该启动子还可直接应用于转基因植株筛选中，可以在植物种子阶段实现筛选，具有阶段性强、筛选灵敏度高的优点。
【IPC分类】A01H5/00, C12N1/21, C12N15/113, C12N15/82
【公开号】CN105177006
【申请号】
【发明人】赵阳, 朱苏文, 王玉, 张敏, 江海洋
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月15日