一种种皮特异性表达启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是植物基因工程技术领域，尤其涉及的是一种种皮特异性表达启动 子及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是基因表达调控的一种重要的顺式作用元件，在植物基因工程中根据 作用方式及功能不同可将其分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子三 类。目前，植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子，如大多数双子叶转基因植 物中使用的花椰菜花叶病毒（CaMV) 35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的 Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。研究发现在组成型启动子的控制下外源基 因的表达存在一些缺陷，如外源基因在植物内持续、高效的表达，必然大量消耗植株体内 的基础物质而造成能量负荷和物质浪费，而基础物质的额外消耗又必然影响和抑制植物 体内的其他代谢活动，同时还会引起植物形态的改变，影响植物的生长发育等。为了使外 源基因在植物体内有效发挥作用，同时减少其对植物的不利影响，人们对组织特异性表达 启动子的研究和应用越来越重视。
[0003] 组织特异性启动子调控下的基因转录过程一般只发生在某些特定的组织或者器 官中。目前已经从植物中分离得到了不同类型的组织特异性启动子，如小麦种子特异性表 达启动子TaPR61，水稻花粉特异性表达启动子Orysl，，马铃薯块莖储藏蛋白patatin基因 启动子等。这些特异性启动子的应用实现了外源基因在植物中时空特异性的表达。种皮特 异性启动子就是这类启动子，可用于调控种皮表达系统改变种皮的颜色，也可以提高所需 要元素的表达量，还可以使外源基因在种皮表达起到保护作用等。因此，利用种子特异性启 动子控制外源基因在种子中特异表达具有重要的理论和实践意义。
[0004] 玉米（Zea mays)是中国最大的粮食、油料及其饲料作物，对其基因工程的研究具 有重要的意义。从玉米中分离获得种皮特异性启动子，可以利用特异性启动子将目的基因 在植物中进行特异性的高效表达，这对玉米进行分子改良或生产具有特殊用途的新玉米品 种等方面有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种种皮特异性表达启动子及其 应用，以提供一种新的、可在植物种子表皮特异性表达的启动子。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明提供了一种种皮特异性表达启动子，该启动子具有如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO. 1所示序列互补的核苷酸序列，该启动子是从玉米自交系 B73中克隆获得的，也可通过人工合成方法获得，命名为PZmD4。
[0008] 本发明还提供了上述种皮特异性表达启动子在驱动植物中目的基因在种皮中特 异性表达的应用。
[0009] 所述的植物包括水稻、玉米。
[0010] 本发明还提供了一种植物表达载体，该植物表达载体含有上述种皮特异性表达启 动子。
[0011] 所述植物表达载体利用上述种皮特异性表达启动子替换双元表达载体 PCAMBIA1301中的CaMV35S启动子构建获得，为一种改进的pCAMBIA1301载体，命名为 pCAM - PZmD4 ;该植物表达载体可用于转基因植株的筛选，具体为：将待转的外源基因连接 至所述植物表达载体的多克隆位点中，并导入植物细胞、组织或器官，获得完熟期的再生植 株种子，将完熟期的再生植株种子经⑶S组织化学染色，若种皮上有蓝色小点，则该种子为 转基因植株种子。
[0012] 本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，该宿主细胞含有上述种皮特异性表 达启动子，或含有上述植物表达载体。
[0013] 所述宿主细胞为根癌农杆菌细胞。
[0014] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种种皮特异性表达启动子及 其应用，该种皮特异性表达启动子为一种新的启动子，其能够启动目的基因在植物的种皮 上特异性表达，实现了外源基因在植物中的时空特异性表达；由于该启动子只能驱动下游 目的基因在植物种皮中表达，从而避免该目的基因在植物其它组织中持续表达所带来的不 利影响；该启动子还可直接应用于转基因植株筛选中，可以在植物种子阶段实现筛选，具有 阶段性强、筛选灵敏度高的优点。
【附图说明】
[0015] 图1为构建的植物表达载体PCR验证和双酶切验证电泳结果图，其中，A为PCR验 证结果，B为双酶切验证结果；
[0016] 图2为转基因植株PCR检测电泳结果图，其中，A为⑶S基因，B为潮霉素 Hyg基 因，C为PZmD4启动子基因；
[0017] 图3为转基因植株不同组织器官的⑶S组织化学染色结果图。
【具体实施方式】
[0018] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0019] 实施例1
[0020] 1、材料
[0021] 本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用 的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0022] 2、方法
[0023] 2. 1种皮特异性表达启动子的获得
[0024] 根据SEQ ID NO. 1所示的PZmD4启动子全长序列，设计PCR扩增引物，所设计的引 物上下游分别加了酶切位点，上游为KpnI (GGTACC)酶切位点，下游为NcoI (CCATGG)酶切位 点。
[0025] 引物序列如下：
[0026] SEQ ID NO. 2 :引物 1 (上游引物）：5' -CGGTACCCTAATCCTATAGCAAATATAGC-3'
[0027] SEQ ID NO. 3 :引物 2 (下游引物）：5 ' -GCCATGGGCAAAGTTGAGAAAACCACA-3 '
[0028] 以玉米自交系B73基因组DNA (全式金公司植物基因组试剂盒提取）为模板，通过 高保真DNA聚合酶Primer Star max扩增获得目的启动子，PCR反应体系为：
[0030] PCR反应条件为：预变性：94°C IOmin ;变性：94°C IOs ;退火：60°C 5s ;延伸： 72°C lmin，33个循环；总延伸：72°C lOmin。值得注意的是在总延伸之前，需要加 Taq酶 0. 5 μ L，为了给3'端加上PolyA尾巴。
[0031] PCR程序反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。切胶回收并纯 化目的片段；将回收片段加载到pEASY TlCloning Vector (购自北京全式金生物技术有限 公司）上，热激法转化到大肠杆菌感受态Trans5a细胞（购自北京全式金生物技术有限公 司）中；通过菌落PCR和酶切检测筛选阳性克隆菌株；对检测结果初步判断正确的连接片 段，送去进行测序（上海生工公司），测序结果与预测结果一致。
[0032] 2. 2含PZmD4启动子的植物表达载体的建立
[0033] 将已连接到pEASY TlCloning Vector上的pZmD4片段（回收小片段）与农杆菌 双元载体PCAMBIA1301 (回收大片段，酶切去除pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子）用KpnI 和NcoI酶进行双酶切并回收片段，酶切条件为：37°C金属浴中3h，酶切30 μ L体系如下：
[0036] 将上述大小片段用T4DNA连接酶进行连接，25°C连接3h，获得连接产物pCAM - pPZmD4质粒，连接10 μ L体系如下：
[0037] CN 105177006 A 说明书 4/8 页
[0038] 将pCAM - pPZmD4质粒轻轻打入到200 μ L的EHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴 5min，液氮速冻lmin，37°C水浴5min后，加入200 μ L YEP液体培养基，28°C，220rpm预表达 4~5h ;1000 Orpm离心30s，弃上清，加入100 μ L YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含 100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL Rif的YEP固体平板上，28°C培养约24~48h ;挑取平板上长 出的微黄色的单菌落，接种于含100 μ g/mL Kan和50 μ g/mL Rif的YEP液体培养液中，摇 菌24~48h ;待菌液浑浊（橙黄色），提取质粒；分别用PCR和双酶切验证，获得如图1所示 的结果，图1中可看出，无论是PCR验证还是双酶切验证，均获得了目的条带，说明pCAM- pPZmD4质粒构建成功。
[0039] 2. 3农杆菌介导水稻转化
[0040] 通过根癌农杆菌（Agrobacterum-mediated)农杆菌介导法将含pCAM - PZmD4表达 载体的农杆菌导入水稻中。水稻遗传转化的过程为：诱导；侵染；选择；分化；生根和移栽。
[0041] 2. 3. 1水稻愈伤组织诱导培养基
[0042] 将 10OmT, N6大量；IOmLN 6微量；lOmLVitamin，所述 IOmLVitamin 为 IL 加 0· Ig 肌 醇粉末；IOmLFe盐；300mg/L脯氨酸；600mg/L水解酪蛋白CH ;30g/L蔗糖；加 dd H2O定容到 700mL，用KOH调pH值至5. 9,加3. Og/L琼脂粉，煮沸，加入2, 4-D储备溶液，用dd H2O定容 至lOOOmL，再分装到组培瓶中，所述组培瓶为25mL/瓶，高压蒸汽灭菌；待用。
[0043] 2. 3. 2侵染培养基
[0044] 将 50mL lN6max ;5mL N6min ;IOmLFe 盐；IOmL Vitamin，所述 IOmLVitamin 为 IL加 〇. Ig肌醇粉末；800mg水解酪蛋白；20g/L蔗糖；加 dd H2O定容至lOOOmL，用KOH调pH值 至5. 6,加3ml/12, 4-D储备溶液，6. 0个/L琼脂粉，高压蒸汽灭菌，待培养基冷却到40°C~ 60°C，加入20mL Glucose葡萄糖储备溶液和1000 mL AS储备溶液，倒平板。
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