c-uc003hsl. 1 (对照为 A549/lnc-NC)。
[0076] 实施例3
[0077] MTT法检测细胞增殖：
[0078] 1)接种细胞：用0. 25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的1640 培养液配成单个A549/sh-lnc-uc003hsl. 1 (对照为A549/lnc-NC)细胞悬液，以每孔2500 个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。分别给药DDP (顺铂，购自江苏恒瑞医药股 份有限公司）或DTX (多西他赛，购自江苏恒瑞医药股份有限公司）。
[0079] 2)培养细胞：将培养板移入C0J?箱中，在37°C、5% CO 2及相对湿度条件下培养， 培养3天。
[0080] 3)呈色：培养第 611、2411、4811、7211、9611后，每孔加入11'1'溶液（511^/1111)2〇111，37°(：， 继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。加入150 μ I DMSO(二甲基亚砜）振荡 lOmin，使结晶物充分溶解。
[0081] 4)比色：490nm波长处测定光密度值（OD)，每组3个复孔，重复三次实验。计算生 存率。生存率=实验组OD值/对照组OD值X 100%。
[0082] 5)结果测定：按如上方法将 A549/sh-lnc-uc003hsl. 1 (对照为 A549/lnc-NC)细 胞株种在96孔板上，2500个细胞/孔。培养第6h、24h、48h、72h、96h后MTT染色法监测细 胞活力。
[0083] 结果分析：A549/sh-lnc-uc003hsl. 1较对照组A549/lnc-NC细胞增殖能力明显受 抑制。观察到此现象，提示干扰lnc-uC〇03hsl. 1表达可以抑制非小细胞肺癌细胞增殖，提 高细胞化疗敏感性。
[0084] 实施例4
[0085] 流式细胞术Annexin V/PI双染色法测细胞凋亡：
[0086] 1)细胞收集：悬浮细胞直接收集到IOml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹 打，凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到IOml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02%的EDTA 消化使之脱壁，每样本细胞数为（1~5) X 106,500~lOOOr/min离心5min弃去培养液。
[0087] 2)用孵育缓冲液洗1次，500~1000r/min离心5min。
[0088] 3)用100 μ 1的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
[0089] 4) 500~1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。
[0090] 5)加入荧光溶液4°C下孵育20min，避光并不时振动。
[0091] 6)流式细胞仪测定细胞凋亡。
[0092] 如上述方法，将A549/sh-lnc-uc003hsl. 1 (对照为A549/lnc-NC)细胞种在6孔板 上，3 X IO5个细胞/孔。转染48h后每组给予顺铂或多西他赛处理，给药48h后流式细胞术 测细胞凋亡水平。
[0093] 结果测定：如图5、6所示。
[0094] 结果分析：与对照组A549/lnc_NC相比，A549/sh-lnc_uc003hsl· 1给予顺钼或多 西他赛处理均出现细胞凋亡增加，提示降低lnc-uC〇03hsl. 1表达可促进非小细胞肺癌细 胞的凋亡，提高细胞化疗敏感性。
[0095] 实施例5
[0096] 流式细胞术检测细胞生长周期（PI染色）：
[0097] 1)细胞收集：用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入1ml 70%预冷乙醇 中，吹打均匀，4°C固定12小时以上。
[0098] 2)PBS 洗涤去乙醇，1000rpm，5min，洗两遍。
[0099] 3)0. 5mlPBS 重悬细胞，加入 PI 和 RNaseA 至终浓度 50 μ g/ml，37°C温浴 30min。
[0100] 4)流式细胞术测定周期。
[0101] 流式细胞术检测细胞周期：如上述方法，将A549/sh-lnc-uc003hsl. 1(对照为 A549/lnc-NC)细胞种在6孔板上，3 X IO5个细胞/孔。转染48h后每组给予顺铂或多西他 赛处理，给药24h后流式细胞术测细胞周期。
[0102] 结果测定：如图7、8所示
[0103] 结果分析：A549细胞降低lnc-uC〇03hsl. 1表达后与对照组相比，给予顺铂或多西 他赛处理均出现细胞周期Gl期阻滞增加，提示干扰lnc-uC〇03hsl. 1表达可抑制非小细胞 肺癌细胞的增殖。
[0104] 实施例6
[0105] 蛋白免疫印迹实验检测lnc-uC〇03hsl. 1对非小细胞肺癌细胞株A549凋亡相关蛋 白bax、bcl-2表达的影响。
[0106] 具体方法如下：
[0107] 1.提取细胞总蛋白
[0108] 2. SDS-PAGE 电泳
[0109] 1)清洗、安装玻璃板，陶瓷片。
[0110] 2)配制灌注分离胶，37°C静置25min。
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[0115] 4)加蛋白样品和分子量marker，每个时期蛋白上样量均为40 μ g。
[0116] 5)恒压电泳（浓缩胶80V，分离胶120V)。
[0117] 1.半干式转膜
[0118] 1)电泳结束后，戴手套，根据目的蛋白分子量范围参照分子量marker切胶（切角 标记），切相同大小硝酸纤维素膜（切角标记）一张和滤纸2张。
[0119] 2)转膜缓冲液中浸泡胶、膜和滤纸lOmin。
[0120] 3)在转膜仪上从下至上平铺：滤纸，膜，凝胶，滤纸，赶除气泡，尤其注意膜和凝胶 之间禁留气泡。擦干多余液体，〇.8mAX膜面积（cm2)电流转膜1.5小时。
[0121] 2.免疫印迹
[0122] 1)转膜结束，检验marker是否已转至膜上（或丽春红染色）以判定转膜效果。 TBST清洗膜后，5%脱脂奶粉（TBST配制）室温摇动2h。
[0123] 2)加一抗bax、bcl_2单克隆抗体（1:1000)(购自cell signal公司），4°C封闭过 夜。
[0124] 3) TBST 漂洗 3 次，每次 5min。
[0125] 4)加二抗（1:10000)(购自 cell signal 公司），室温摇动 2h。
[0126] 5)TBST 漂洗 3 次，每次 lOmin。
[0127] 3. ECL 检测
[0128] I) AB液混合，待膜不滴水后，平铺其上。
[0129] 2)反应5min后，根据焚光强度暗室压片5~30min。
[0130] 3)显影15~30s，水洗，定影1~3min。
[0131] 4)图片扫描和定量分析。
[0132] 5)按上述方法，A549/sh-lnc-uc003hsl. 1 (对照为 A549/lnc-NC)，细胞给予 DDP 5ug/ml 48h后提取细胞总蛋白检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2表达水平。蛋白水平变化如 图9所示。
[0133] 与对照组相比，降低lnc_uc003hsl. 1表达可明显上调凋亡蛋白bax表达水平，下 调抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平，提示降低lnc-uc003hsl. 1表达可促进非小细胞肺癌细胞 的凋亡，增加非小细胞肺癌细胞对化疗药的敏感性，可作为肿瘤治疗的干预靶点。
【主权项】
1. 一种长非编码RNA，其核苷酸序列为SeqNO. 1。2. 根据权利要求1所述一种长非编码RNA在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA？uc003hsl.1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用；通过改变长非编码RNA？uc003hsl.1的表达对非小细胞肺癌细胞的凋亡、增殖、药物敏感性等产生影响，说明降低长非编码RNA？uc003hsl.1表达能够促进非小细胞肺癌细胞凋亡、抑制其增殖、增强其对化疗药物的敏感性。
【IPC分类】C12N15/113, A61K48/00, A61P35/00
【公开号】CN105177005
【申请号】
【发明人】王朝霞, 魏晨晨, 陈沁楠, 姜黎黎
【申请人】南京医科大学第二附属医院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月13日