A549凋亡及 周期影响的机制研究。
[0036] I. A549细胞株分别转染lnc-uC〇03hsl. 1慢病毒干扰载体，空脂质体转染（A549/ Inc-NC)设为对照组。转染24h后给予顺铂5ug/ml，48h后提取细胞总蛋白检测凋亡蛋白水 平。
[0037] 2.结果测定：如图9所示。
[0038] 3.结果分析：与对照组相比，转染lnc_uc003hsl. 1慢病毒干扰载体可明显上调蛋 白bax表达水平，下调抗凋亡蛋白bcl-2表达水平，提示降低lnc-uc003hsl. 1表达可促进 肿瘤细胞的凋亡。上述实验结果提示降低lnc-uc003hsl. 1表达能够促进非小细胞肺癌细 胞的凋亡，可作为肿瘤治疗的干预靶点。
[0039] 有益效果
[0040] 1.通过lnc_uc003hsl. 1对非小细胞肺癌细胞凋亡、增值、化疗药物敏感性的影 响，说明降低lnc-uc003hsl. 1表达可促进非小细胞肺癌细胞凋亡；将细胞周期抑制在Gl期 从而抑制细胞增殖；增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性。
[0041 ] 2.目前较为常用的干扰IncRNAs的方法，有体外制备IncRNAs慢病毒干扰载体转 染到细胞并在体内起到降低IncRNAs表达的作用。本发明采用了前一种方法，本法简便且 具有较高的转染效率。
【附图说明】
[0042] 图1基因芯片分析正常肺组织与肺癌组织中长链非编码RNA表达谱的情况
[0043] (A为Sample A是正常肺组织；B为Sample B是肺癌组织，Ritio为SampleB / Sample A的信号比值）。
[0044] 图2 qRT-PCR测正常肺上皮细胞株16HBE与非小细胞肺癌细胞株A549 lnc-uc003hsl. 1表达水平，GAPDH设为内参。
[0045] 图3、4为MTT法测改变lnc-uc003hsl. 1表达前后非小细胞肺癌细胞株A549对于 顺铂和多西他赛的敏感性影响。图3为A549细胞株进行顺铂处理后的IC50 ;图4为A549 细胞株进行多西他赛处理后的IC50。
[0046] 图5、6为流式细胞术测改变lnC-uC〇03hsl. 1表达前后非小细胞肺癌细胞 株A549对于顺铂和多西他赛的细胞凋亡变化，其中a为A549/lnc-NC，b为A549/ sh-lnc_uc-〇03hsl· 1，c 为凋亡率比较。
[0047] 图7、8为流式细胞术测改变lnc-uc003hsl. 1表达前后非小细胞肺癌细胞株A549 对于顺铂和多西他赛的Gl期变化。
[0048] 图9蛋白免疫印迹检测结果。
【具体实施方式】
[0049] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
[0050] -般性说明：
[0051] 实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的 《分子克隆实验指南（第 3 版）》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.黄培 堂等译，科学出版社.2002. 8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方 法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
[0052] 本发明的材料：本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供 应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的 工具和生物材料来代替。
[0053] 实施例1
[0054] 检测lnc_uc003hsl. 1在组织和细胞中的表达情况
[0055] (一）：lnc-uc003hsl. 1在正常肺组织与肺癌组织中的表达情况：
[0056] 1.芯片制备及分析：按照中国的博奥公司的要求准备正常肺组织与肺癌组织标 本，交由博奥公司进行芯片制备，晶芯@人类长链非编码RNA芯片VI. 0版本完成芯片分析， 该芯片包含众多LncRNAs数据库最新版本以及数万条LncRNAs检测的探针。该芯片的检 测原理是根据IncRNA序列长度和结构特征，采用随机引物和Ologo(dT)相结合的逆转录 方式引入T7启动子，再通过进行体外转录介导的线性扩增方法对RNA进行扩增，RNA线性 扩增方法用于微阵列芯片分析中样品标记。将线性扩增产物cDNA反转录得到的DNA，再用 KlenowFragent酶对DNA进行焚光标记，最终实现焚光标记的DNA产物与芯片上的Oligo探 针杂交，进行基于芯片的基因表达分析。通过IncRNA芯片检测，研究人员能够快速高通量 的获得与特定生物学过程或者疾病相关的IncRNA的表达变化。博奥生物IncRNA芯片检测 样品标记过程，主要包括如下步骤：
[0057] 1).从Total RNA的样品开始，用含有T7启动子序列的T7 Oligo (dT)Primer和 T7RandomPrimer 为引物，使用 CbcScript 酶合成 lst-strand cDNA。
[0058] 2) · Second strand DNA 合成：用 RNaseH、DNA Polymerase 将 DNA-RNA 杂合体中的 RNA链转化为Second strand cDNA，合成双链DNA并进行DNA过柱纯化。
[0059] 3) ·体外转录合成cDNA :以双链DNA为模板利用T7Enzyme Mix合成cDNA，这一步 对RNA进行扩增。
[0060] 4). cDNA纯化：使用RNA纯化柱纯化cDNA，出去反应中的盐、酶等试剂，并对cDNA 进行定量。
[0061] 5). cDNA 反转录：以 cDNA 为模板，Random Primer 为引物，CheScriptII 酶进行反 转录。过柱纯化并回收cRNA反转录得到的cDNA。
[0062] 6). cDNA焚光标记：以反转录的cDNA产物为模板，Random Primer为引物，用 Klenow Fragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的Cy3-dCTP或Cy5-dCTP。纯化 并定量标记产物。这些带有荧光基团DNA即可用于芯片杂交。
[0063] 芯片筛选出在肺癌组织中特异性高表达的IncRNAs后，研究员通过qRT-PCR 方法扩增DNA来鉴定得到的即为目的DNA(lnc-uc003hsl. I)，lnc-uc003hsl. 1的 引物如下：F Primer 5' -agcagcaacaaacaatcctga-3'，见 SEQ NO :4，R Primer 5' -Ccacaagtcatttcaccaagg-Si，见 SEQ NO :5〇
[0064] 2.芯片结果：实验数据来自博奥公司，结果如图1及表格1所示。
[0065] 表一显著性差异列表
[0068] 3.结果分析：lnc-uc003hsl. 1在肺癌组织（Sample B)中信号为293. 4204,在 正常肺组织（3&1^16 4)中信号为9.1301，1^衍〇(531^16 8/531^16 4)为 32.1377，表示 lnc-uc003hsl. 1在肺癌组织中高表达，在正常肺组织中低表达，二者差异达32. 1377倍，提 示lnc-uc003hsl. 1在肺癌中可能作为一个癌基因发挥作用。
[0069] (二）qRT-PCR分析lnc-uc003hsl. 1在正常肺组织细胞株16HBE及非小细胞肺癌 细胞株A549的表达谱
[0070] 1.方法：Trizol 试剂提取细胞总 RNA，qRT-PCR 运用 SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，大连，中国），人GAPDH作为内参。
[0071] 2. qRT-PCR结果：如图2所示。
[0072] 3.结果分析：lnc-uc003hsl. 1在正常肺组织细胞株16HBE中低表达，在非小细胞 肺癌细胞株A549中高表达，与基因芯片结果一致。
[0073] 实施例2
[0074] 构建lnc-uc003hsl. 1慢病毒干扰载体转染细胞：
[0075] 设计特异性的针对lnc-uC〇03hsl. 1的干扰序列，其序列为（5' to 3'）： CCAGATGGGCACTTCTAAA，见Seq NO. 2,以干扰GAPDH基因的序列片作为对照，并将其插入慢 病毒载体中（以上载体及片段由invitrogen公司合成）。将包装好的慢病毒载体感染非小 细胞肺癌细胞株A549细胞，起到下调lnc-uC〇03hsl. 1表达的作用，48h后用G418筛选稳定 转染细胞系，命名为 A549/sh-ln