5分钟后收集菌体，用IOml 0. 15M的预冷NaCl 溶液重悬菌体，4°C 5000rpm离心10分钟后再次收集菌体。用Iml预冷的20mM CaCl2溶液 重悬菌体，加入0. 5mL 50 %甘油，充分混匀获得农杆菌感受态细胞。在农杆菌感受态细胞中 加入表达载体DNA，轻轻吹打混匀，置于冰上30分钟后用液氮速冻1分钟，然后用37°C水浴 热激3分钟。加入1ml LB培养液28°C 180rpm培养30分钟，涂布于加有相应抗生素的LB 固体培养基上，28°C倒置培养2天后挑选克隆，保存农杆菌转化体。
[0061] (3)用农杆菌介导miR159a及其靶向GAMYB基因在烟草叶片中瞬时共表达。将转 化相应表达载体的农杆菌菌株在LB固体培养基上划线，两日后挑取农杆菌单菌落，在LB培 养液中230rpm 28°C培养过夜。过夜培养物按1:50转接到8ml LB培养液（含IOmM MES及 0. 02mM乙酰丁香酮）中，继代培养至OD6。。为1. 5后3000rpm离心15分钟收集菌体，重悬菌 体至0D6。。为0· 7,24°C避光静置4小时后注射4周大小的烟草（Nicotiana benthamiana) 叶片。在烟草叶片中注射转化了 miR159a表达载体的农杆菌菌株后保湿培养24h，在注射原 位置再次注射转化了 GAMYB基因表达载体的农杆菌菌株，培养48h后取注射位置的叶片组 织，提取总RNA及总蛋白。
[0062] (4)miR159a表达量分析及GAMYB蛋白积累量分析。对提取的烟草叶片总RNA进 行反转录获得cDNA，按照RT-PCR反应体系和条件在不同的循环数下扩增样品的内参基因 Actin (肌动蛋白基因）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过DNA条带亮度检验模板量是 否一致；若不一致，将产物亮度较高的模板进行一定倍数的稀释，直至产物亮度基本一致。 此时，通过RT-PCR反应检测miR159a的表达量（图4)。利用抗HA多克隆抗体，通过蛋白印 迹法检测出烟草叶片总蛋白中GAMYB蛋白的积累量（图4)，通过相应的表达载体，利用农杆 菌介导miR159a和GAMYB蛋白在烟草中瞬时共表达，并以空载体和GAMYB的瞬时共表达作 为负对照，研究过表达miR159a对GAMYB蛋白积累的影响。
[0063] 检测miR159a表达量所需的qPCR引物如下：
[0064] 正向：5'-CGGCGGTTTGGATTGAAGGGA-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0065] 反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0066] 内参 ACTINl (肌动蛋白）正向：5'-TGGCACCCGAGGAGCACC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0067] 内参 ACTINl (肌动蛋白）反向：5'-GTAACCTCTCTCGGTGAG-3'。（SEQ ID NO. 12)
[0068] 实验结果表明，在烟草中通过共注农杆菌法过表达miR159a后，可以显著抑制 GAMYB蛋白的积累（图4)，说明miR159a确实靶向GAMYB基因并负向调控其蛋白积累量。 由于miR159a负向调控GAMYB基因的表达量，miR159a在大麦对白粉病抗性中的作用，与 GAMYB基因在大麦对白粉病抗性中的作用相反。当共表达空载体和GAMYB时，GAMYB蛋白有 一定数量的积累，而共表达miR159a和GAMYB时，已经检测不到GAMYB蛋白的积累，说明在 烟草中过表达miR159a可抑制GAMYB蛋白的积累。
[0069] 实施例4大麦表皮细胞中过表达miR159a靶标基因 GAMYB对大麦白粉病菌抗性的 研究
[0070] (1)将miR159a靶标基因 GAMYB克隆到克隆载体pENTRY中，并进一步通过LR反应 将该基因整合到表达载体CTAP中。
[0071] 克隆GAMYB基因所需的引物如下：
[0072] 正向：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTACC
[0073] GGGTGAAGAGCGAG-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0074] 反向：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTTGAATT
[0075] CCTCCGACATTTGAC-3'。（SEQ ID NO. 14)
[0076] (2)基因枪介导的大麦单细胞基因瞬时过表达。取9mg金粉，在65°C烘干4h后加 入Iml 70%乙醇，震荡清洗5min，静置15min沉降，离心2秒后弃上清。加入1ml灭菌去离 子水后震荡2min，放置Imin后离心2秒，弃上清。重复2次后加入1ml 50%甘油，震荡混 匀。将准备好的金粉震荡5min后，将质粒DNA与GUS报告基因表达质粒等摩尔混合，加去 离子水至5 μ 1 ;在50 μ 1金粉中加入质粒DNA混合物，在震荡的同时逐滴加入50 μ I 2. 5M CaCl2，然后快速加入20 μ 1 0.1 M亚精胺，继续震荡3min。静置Imin沉降，离心2秒后弃上 清，分别用140 μ 1 70%乙醇和140 μ 1 100%乙醇洗涤，之后加入12 μ 1 100%乙醇后震荡 混匀。
[0077] 使用型号为FOS-lOOO/He delivery system(Bio-Rad)的基因枪进行轰击。将载 体膜放到载体膜支撑盘中，将金粉均匀涂抹在载体膜中央后凉干；将爆破膜片放置到爆破 膜片夹盘，固定在加速器上；将载体膜支撑盘加上阻挡网，放置到轰击室第一层，并将载有 叶片的平板放在第三层后抽真空，待真空值达到27英寸汞柱后发射轰击。轰击后将叶片在 培养皿上摆好，放入人工气候箱静置培养。
[0078] (3)接种白粉菌及吸器指数统计。接菌时取带有成熟白粉菌孢子的大麦植株在接 受过基因枪轰击的叶片上方轻轻抖动，使孢子均匀下落；静置3min后封好培养皿，放入人 工气候箱静置培养。将培养48h的大麦离体叶片浸在GUS染色液中染色，抽真空3次、每次 5min，期间轻轻颠倒；37°C温育过夜，之后将叶片浸在脱色液中室温脱色两天。将叶片在清 水中清洗lh，在考马斯亮蓝溶液中染色10秒，用水清洗2次；叶片正面朝上放置到载玻片 上，滴50%甘油，压上盖玻片，在显微镜下观察。分别统计感病（含有吸器和次级菌丝）和 抗病（只有附着胞）的、表达GUS的细胞数目，感病细胞数目与统计细胞数目总和的比值即 为吸器指数。
[0079] 本实验利用基因枪介导在大麦表皮单细胞中瞬时过表达miR159a的靶标基因 GAMYB，以瞬时过表达空载体为负对照，结合之后的白粉菌接种和吸器指数统计，研究了在 大麦表皮细胞中过表达miR159a的靶标基因 GAMYB对大麦白粉病菌抗性的影响。实验结果 表明，在大麦表皮单细胞中用基因枪轰击法过表达miRl59a的靶标基因 GAMYB后，大麦细胞 对白粉菌的本底抗性有所下降，表现为在接种毒性白粉菌小种后吸器指数较对照有所上升 (图5左图），而大麦细胞对白粉菌的小种专化抗性明显下降，表现为接种无毒白粉菌小种 后吸器指数较对照明显上升（图5右图），说明GAMYB基因是大麦抗白粉病的负调因子，进 一步说明miR159a可以正向调节大麦细胞对白粉菌的抗病性。
[0080] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 与大麦抗白粉病相关的miRNA，其为miR159a，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 如权利要求1所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA，其前体的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。3. 如权利要求1所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA，其特征在于，其靶标基因为 GAMYB基因，GAMYB基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。4. 含有权利要求1-3任一所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA的表达载体。5. 如权利要求1-3任一所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA或其表达促进剂或权利要 求4所示的表达载体在负向调控GAMYB基因中的应用。6. 如权利要求1-3任一所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA或其表达促进剂或权利要 求4所;^的表达载体在提尚大麦抗白粉病抗性中的应用。7. 如权利要求1-3任一所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA或其表达促进剂或权利要 求4所示的表达载体在大麦种质资源改良中的应用。8. 如权利要求1-3任一所述的与大麦抗白粉病相关的miRNA或其表达促进剂或权利要 求4所示的表达载体在制备转基因大麦中的应用。9. 用于克隆miR159a的PCR特异性引物对，其特征在于，上游引物如SEQIDNO. 7所 示，下游引物如SEQIDNO. 8所示。10. 含有权利要求9所示的特异性引物对的试剂盒在筛选培育抗白粉病大麦中的应 用。
【专利摘要】本发明提供了与大麦抗白粉病相关的miR159a及其应用，属于基因工程领域与作物分子生物学领域。本发明的miR159a来源于大麦，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，其靶标基因是GAMYB，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示。本发明发现在大麦表皮细胞中瞬时过表达能够使大麦细胞对白粉菌的抗性减低，本发明还发现GAMYB基因的表达受miR159a的负向调控，负向调控GAMYB基因表达的miR159a可以正向调控大麦对白粉病菌的抗性。本发明提供的与大麦抗白粉病相关的miR159a可用于大麦种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白粉病的大麦品种，具有良好的市场应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/11
【公开号】CN105177002
【申请号】
【发明人】刘杰, 沈前华, 谷成, 程溪柳
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月15日