过表达载体时以号标示。利用HA标签的抗 体，通过蛋白印迹法检测出HA的积累量代表了其融合蛋白GAMYB的积累量，而丽春红染料 (定量蛋白质上样量染料）染色显示了不同实验处理的蛋白样品上样量均匀一致。在检测 miR159a表达量的实验中，对作为内参的肌动蛋白的表达量的检测显示了不同实验处理中 所用核糖核酸量均匀一致。
[0029] 图5为大麦表皮细胞中过表达miR159a的靶标基因 GAMYB对大麦白粉病菌抗性的 影响。白粉菌吸器指数代表了大麦表皮转化细胞的感病性，数值越高说明大麦表皮细胞越 感病。用毒性白粉菌小种A6(图5左图）和无毒白粉菌小种Kl (图5右图）接种瞬时过表 达了空载体或GAMYB基因的、遗传背景中含有MLAl基因的大麦品种POl的叶片后，可以看 出过表达miR159a的靶标基因 GAMYB可导致大麦细胞对白粉菌的本底抗性（图5左图）和 小种专化抗性（图5右图）均有所下降。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0031] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中使用的大麦品种均为P01，记载在 Shen et al，2007, Science中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所（以下简称 为"中科院遗传所"）获得；大麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp.hordei)生理小种Kl和 A6记载在Shen et al，2003, Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得；CTAP载体记载 在Bai et al，2012，PLoS Pathog.中，公众可从中科院遗传所获得；pKANNIBAL载体记载在 Liu et al, 2014, PLoS Genet.中，公众可从中科院遗传所获得；pUbi载体记载在Shen et al，2003, Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得。
[0032] 实施例1 miR159a在大麦白粉菌侵染大麦过程中的表达谱分析
[0033] (1)植物材料的准备。大麦品种POl种子播种后，待长至1周左右，剪下旗叶，叶面 朝上，放置于含有培养基（1 %琼脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复24小时后分别接 种大麦白粉病菌生理小种Kl或A6,并分别在接种后不同时间点取叶片材料。
[0034] (2)植物总RNA的提取。在液氮中迅速研磨300mg大麦叶片至粉末状，加入 Iml TRizol，充分震荡混勾后于4°C 12, OOOrpm离心10min;上清转移到新离心管中，加入 l/5TRizol体积的氯仿，混勾后室温静置3min等待其分层，之后于4°C 12, OOOg离心15min。 上清转移到新离心管中，先加入上清体积10%的3M醋酸钠 （pH 5. 2)，混匀后再加入上清体 积1倍的异丙醇，混匀后于_20°C中静置60min。4°C 10, OOOg离心15min，弃上清，用75% 乙醇洗涤沉淀两次，每次室温静置lOmin，之后4°C 7500rpm离心5min，沉淀在室温下晾置 10min。用60 μ I DEPC水溶解沉淀，获得的植物总RNA。
[0035] (3) Stem-loop real-time qPCR 的反转录反应。
[0036] 反应所需的引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCA GAGCT-3' 〇 (SEQ ID NO. 4)
[0037] 反转录体系为：dNTP 1 μ 1，50nM stem-loop RT primer 1 μ 1，加 DEPC H2O 至 10 μ 1，65 °C 变性 5min，冰上冷却 2min ;之后加入 10XM-MLV buffer 2 μ 1，RNase inhibitor 0.5 μ 1，M-MLV 1 μ 1，总 RNA 2 μ g，加 DEPC H2O 至 20 μ 1。反转录条件为： 16°C 30min，42°C 30min，85°C 5min。
[0038] (3) Stem-loop real-time qPCR 的其他实验方法参考文献 Chen et al，2007, Nucleic Acids Res.。按照以下体系配置荧光定量PCR反应液：2XqPCR Mix 5μ1，100χ CXR 0· 1以1，10 4]\1正向引物0.2 4 1，1(^]\1反向引物0.2 4 1，加(1(1!120至1(^1。 接着，将上述反应液以8 μ 1/管分装到qPCR专用小管中，每管分别加入2 μ 1待测模板cDNA 混匀，离心使反应液聚集在管底，盖膜。然后，按照以下程序在ABI荧光定量PCR仪上进行反 应：95°C 10min，95°C 15sec，60°C lmin，40 个循环。设置溶解曲线：95°C 10sec，65°C lmin， 0. 2°C阶梯升温，读荧光值，升温至95°C结束。检测miR159a表达量所需的qPCR引物如下：
[0039] 正向：5,-CGGCGGTTTGGATTGAAGGGA-3，；（SEQ ID NO. 9)
[0040] 反向：5,-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，；（SEQ ID NO. 10)
[0041] 用毒性白粉菌小种A6和无毒白粉菌小种Kl接种遗传背景含有MLAl基因的大麦 品种P01，在接种0、4、16、22和48小时后采集叶片样品，并检测叶片组织中miR159a的相对 表达量，进而研究白粉菌侵染对大麦miR159a表达水平的影响。用Stem-loop real-time qPCR方法可以检测出这些叶片样品中miR159a的相对表达量。实验结果见图1，用毒性白 粉菌小种A6接种大麦品种POl可以反映出大麦对白粉菌的本底抗性，而用无毒白粉菌小种 Kl接种大麦品种POl可以反映出大麦对白粉菌的小种专化抗性。结果表明，无论是在接种 毒性白粉菌小种后的本底抗性中，还是在接种无毒白粉菌小种后的小种专化抗性中，大麦 细胞中miR159a的表达丰度都随时间变化有显著上升，说明miR159a参与大麦对白粉病菌 的抗性过程并发挥相应的生物学功能。miR159a的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其前体 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0042] 实施例2对miR159a靶标基因 GAMYB基因的预测及克隆
[0043] (I)miRNA革巴标基因预测。
[0044] 对miR159a靶标基因的预测在psRNATarget网站上在线完成，参数设置为默认。 (psRNATarget 网站地址：http://plantgrn. noble. org/psRNATarget/)发现转录因子 GAMYB基因可能为miR159a的靶标基因（见图2)。
[0045] (2)GAMYB基因的克隆。大麦品种POl的7天幼苗接种大麦白粉菌生理小种K1，24 小时后取叶片材料，提取RNA后进行反转录获得cDNA。反转录体系和过程如下：RNA 2 μ g， 01ig〇-dT 1 μ 1，加 DEPC-H2O至12 μ 1，离心管混合上述溶液后于70°C变性10分钟，再于 冰上冷却2分钟，之后在离心管中继续加入M-MLV Buffer 2 μ l，dNTP mix 1 μ 1，RNase inhibitorO. 5 μ 1，M-MLV I μ 1，加 DEPC-H2O 至 20 μ 1，于 42°C温浴 I 小时，70°C保温 15 分 钟后获得反转录的cDNA。
[0046] 克隆GAMYB基因的PCR扩增所需的引物如下：
[0047] 正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0048] 反向：5,-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3,（SEQ ID NO. 6)。
[0049] PCR 反应体系为：KOD buffer 5yl，MgS042 yl，dNTP 5yl，cDNA 2μ1，正、反向引 物各 1μ1，Κ(? plus酶 1以1，加氏0 至50μ1。PCR 反应程序为：94°C 3min+(94°C 30s+58°C 30s+68°C 90s) X30 个循环 +68°C 10min。
[0050] 反应得到1662bp的PCR产物，将该PCR产物测序，结果为序列表中序列3所示的 核苷酸序列，该序列所示的基因命名为GAMYB ;该基因编码的蛋白命名为GAMYB，该蛋白的 氨基酸序列为序列表中的序列15。
[0051] 实施例3对miR159a靶向GAMYB基因并负向调控其表达的验证
[0052] (1)将miR159a及其靶标基因 GAMYB分别克隆到表达载体pKANNIBAL和CTAP中。
[0053] 克隆miR159a的PCR扩增所需的引物如下：
[0054] 正向：5'-GTTCCTCGAGCCGTTCCATATCTTCTAGCCCC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0055] 反向：5,-CCTCAAGCTTTTGAGGGGAAAACAAAACACCG-3,（SEQ ID NO. 8)。
[0056] 克隆GAMYB基因的PCR扩增所需的引物如下：
[0057] 正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3'（SEQ ID NO. 5);
[0058] 反向：5'-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0059] 在烟草中过表达miR159a和GAMYB基因所用的载体中相应的表达框架见图3。
[0060] (2)农杆菌的转化。将农杆菌菌株GV3101在LB固体培养基上划线培养，两日后挑 取单菌落，在LB培液基中180rpm 28°C过夜培养。过夜培养物扩大培养至0D_为0. 5后， 将菌液置于冰上30分钟，4°C 3000rpm离心1