于在烟草中过表达miR167d和ARFl基因的载体区段示意图。其中，HA标 签融合到ARFl蛋白的C末端，用于通过蛋白印迹法监测ARFl蛋白的积累量；图中箭头标示 出ARFl基因中被miR167d靶向的位点。
[0030] 图4为在烟草中过表达miR167d抑制ARFl蛋白的积累效果图。实验处理中含有该 过表达载体时以" + "号标示，不含有该过表达载体时以号标示。利用HA标签的抗体， 通过蛋白印迹法检测出HA的积累量代表了其融合蛋白ARFl的积累量，而丽春红染料染色 显示了不同实验处理的蛋白样品上样量均匀一致。在检测miR167d表达量的实验中，对作 为内参的肌动蛋白的表达量的检测显示了不同实验处理中所用核糖核酸量的情况。
[0031] 图5为大麦表皮细胞中过表达miR167d的靶标基因 ARFl对大麦白粉病菌抗性的 影响效果图。白粉菌吸器指数代表了大麦表皮转化细胞的感病性，数值越高说明大麦表皮 细胞越感病。其中左图和右图分别为用毒性白粉菌小种A6和无毒白粉菌小种Kl接种瞬时 过表达了空载体或ARFl基因的、遗传背景中含有MLAl基因的大麦品种POl的叶片后效果 图，可以看出过表达miR167d的靶标基因 ARFl可导致大麦细胞对白粉菌的本底抗性（左 图）和小种专化抗性（右图）均有所下降。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0033] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中使用的大麦品种均为P01，记载在 Shen et al，2007, Science中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所（以下简称 为"中科院遗传所"）获得；大麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp.hordei)生理小种Kl和 A6记载在Shen et al，2003, Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得；CTAP载体记载 在Bai et al，2012，PLoS Pathog.中，公众可从中科院遗传所获得；pKANNIBAL载体记载在 Liu et al, 2014, PLoS Genet.中，公众可从中科院遗传所获得；pUbi载体记载在Shen et al，2003, Plant Cell中，公众可从中科院遗传所获得。
[0034] 实施例1 miR167d在大麦白粉菌侵染大麦过程中的表达谱分析
[0035] (1)植物材料的准备。大麦品种POl种子播种后，待长至1周左右，剪下旗叶，叶面 朝上，放置于含有培养基（1 %琼脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培养皿上，恢复24小时后分别接 种大麦白粉病菌生理小种Kl或A6,并分别在接种后不同时间点取叶片材料。
[0036] (2)植物总RNA的提取。在液氮中迅速研磨300mg大麦叶片至粉末状，加入 Iml TRizol，充分震荡混勾后于4°C 12, OOOrpm离心10min;上清转移到新离心管中，加入 l/5TRizol体积的氯仿，混勾后室温静置3min等待其分层，之后于4°C 12, OOOg离心15min。 上清转移到新离心管中，先加入上清体积10%的3M醋酸钠 （pH 5. 2)，混匀后再加入上清体 积1倍的异丙醇，混匀后于_20°C中静置60min。4°C 10, OOOg离心15min，弃上清，用75% 乙醇洗涤沉淀两次，每次室温静置lOmin，之后4°C 7500rpm离心5min，沉淀在室温下晾置 10min。用60 μ I DEPC水溶解沉淀，获得的植物总RNA。
[0037] (3) Stem-loop real-time qPCR 的反转录反应。
[0038] 反应所需的引物：5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAG AT-3'。（SEQ ID NO. 4)
[0039] 反转录体系为：dNTP 1 μ 1，50nM stem-loop RT primer 1 μ 1，加 DEPC H2O 至 10 μ 1，65 °C 变性 5min，冰上冷却 2min ;之后加入 IOXM-MLV buffer 2 μ 1，RNase inhibitor 0.5 μ 1，M-MLV 1 μ 1，总 RNA 2 μ g，加 DEPC H2O 至 20 μ 1。反转录条件为： 16°C 30min，42°C 30min，85°C 5min。
[0040] (4) Stem-loop real-time qPCR 的实验方法参考文献 Chen et al, 2007, Nucleic Acids Res.。按照以下体系配置荧光定量PCR反应液：2x qPCR Mix5 μ 1，IOOx CXR 0· I μ 1， 10 μ M正向引物0. 2 μ 1，10 μ M反向引物0. 2 μ 1，加 CldH2O至10 μ 1。接着，将上述反应液 以8 μ 1/管分装到qPCR专用小管中，每管分别加入2 μ 1待测模板cDNA混勾，离心使反应 液聚集在管底，盖膜。然后，按照以下程序在ABI荧光定量PCR仪上进行反应：95°C，lOmin， 95°C 15sec，60°C lmin，40 个循环。最后，设置溶解曲线：95°C 10sec，65°C lmin，-0.2°C阶 梯升温，读荧光值，升温至95°C结束。
[0041] 检测miR167d表达量所需的qPCR引物如下：
[0042] 正向：5,-TCGCGTGAAGCTGCCAGCATG-3，；（SEQ ID NO. 9)
[0043] 反向：5,-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，；（SEQ ID NO. 10)
[0044] 用白粉菌小种Kl或A6接种含有MLAl基因的大麦品种POl，在0、4、16、22和48 小时后收取叶片样品，用Stem-loop real-time qPCR方法可以检测出这些叶片样品中 miR167d的相对表达量。实验结果见图1，结果表明，无论是在接种毒性白粉菌小种后的本 底抗性中，还是在接种无毒白粉菌小种后的小种专化抗性中，大麦细胞中miR167d的表达 丰度都随时间变化有显著上升，说明miR167d参与大麦对白粉病菌的抗性过程并发挥相应 的生物学功能。miR167d的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其前体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0045] 实施例2对miR167d靶标基因 ARFl基因的预测及克隆
[0046] (I)miRNA革巴标基因预测。
[0047] 对miR167d靶标基因的预测在psRNATarget网站上在线完成，参数设置为默认。 (psRNATarget 网站地址：http://plantgrn. noble. org/psRNATarget/)ARFl 基因被预测为 miR167d的靶标基因之一（见图2)。
[0048] (2)ARFl基因的克隆。大麦品种POl的7天幼苗接种大麦白粉菌生理小种Kl，24 小时后取叶片材料，提取RNA后进行反转录获得cDNA。反转录体系和过程如下：RNA 2 μ g， 01ig〇-dT 1 μ 1，加 DEPC-H2O至12 μ 1，离心管混合上述溶液后于70°C变性10分钟，再于 冰上冷却2分钟，之后在离心管中继续加入M-MLV Buffer 2 μ l，dNTP mix 1 μ 1，RNase inhibitor 0· 5 μ 1，M-MLV I μ 1，加 DEPC-H2O 至 20 μ 1，于 42°C温浴 I 小时，70°C保温 15 分 钟后获得反转录的cDNA。
[0049] 克隆ARFl基因的PCR扩增所需的引物如下：
[0050] 正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0051] 反向：5'-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0052] PCR 反应体系为：KOD buffer 5yl，MgS042 yl，dNTP 5yl，cDNA 2μ1，正、反向引 物各 1μ1，Κ(? plus酶 1以1，加氏0 至50μ1。PCR 反应程序为：94°C 3min+(94°C 30s+58°C 30s+68°C 90s) X30 个循环 +68°C 10min。
[0053] 反应得到2676bp的PCR产物，将该PCR产物测序，结果为序列表中序列3所示的 核苷酸序列，该序列所示的基因命名为ARFl ;该基因编码的蛋白命名为ARF1，该蛋白的氨 基酸序列为序列表中的序列15。
[0054] 实施例3对miR167d靶向ARFl基因并负向调控其表达的验证
[0055] (1)将miR167d及其靶标基因 ARFl分别克隆到表达载体pKANNIBAL和CTAP中。
[0056] 克隆miR167d的PCR扩增所需的引物如下：
[0057] 正向：5'-GTTCCTCGAGCCGTTCCATATCTTCTAGCCCC-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0058] 反向：5,-CCTCAAGCTTTTGAGGGGAAAACAAAACACCG-3,（SEQ ID NO. 8)。
[0059] 克隆ARFl基因的PCR扩增所需的引物如下：
[0060] 正向：5'-ATGTACCGGGTGAAGAGCGAG-3'（SEQ ID NO. 5);
[0061] 反向：5'-TTTGAATTCCTCCGACATTTGAC-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0062] 在烟草中过表达miR167d和ARFl基因所用的载体中相应的表达框架见图3。
[0063] (2)农杆菌的转化。将农杆菌菌株GV3101在LB固体培养基上划线培养，两日后挑 取单菌落，在LB培液基中180rpm 28°C过夜培养。过夜培养物扩大培养至0D_为0. 5后， 将