与大麦抗白粉病相关的miR167d及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及与大麦抗白粉病相 关的miR167d及其应用。
【背景技术】
[0002] 大麦是在全球广泛种植的主要粮食作物之一，其世界播种面积仅次于小麦、水稻 和玉米，位列第四。大麦可做食品、饲料和啤酒酿制原料，具有重要的经济价值。大麦白 粉病（barley powdery mildew)是大麦主要的真菌病害之一，由布氏白粉菌大麦专化型 (Blumeria graminis f.sp.hordei)引起。该病原真菌属子囊菌纲白粉菌目，主要在宿主大 麦叶片表皮细胞内专性活体寄生，可侵害大麦植株的地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主， 发病重时大麦茎杆和穗部也受侵害（Jorgensen, 1994, Crit. Rev. Plant Sci.)。大麦白 粉病多发生在潮湿和半潮湿地区，分布于世界各大麦产区。在欧洲各国、北美东部和南部地 区、日本等地，以及中国的贵州、四川和东南沿海等大麦种植区域均有普遍发生，一般可造 成20% -25%的产量损失，而在病害流行的年份里严重损失可达30%。近年来，由于大麦品 种单一化、高度密植和过量施用氮肥等栽培因素，使得大麦白粉病发病日趋严重。
[0003] 目前全球大麦白粉病的防治工作主要通过施用化学农药完成。三唑类（triazole) 杀菌剂是有机杂环类化合物，是近四十年来针对麦类白粉病开发的广谱、内吸、高效的化学 杀菌剂，适用范围广、使用方法灵活，对大麦白粉病的防治效果较好。三唑类杀菌剂的作用 机制是抑制病原真菌麦角留醇的生物合成，使菌体细胞膜结构和功能受到破坏，进而抑制 或干扰菌体附着胞及吸器的发育、以及菌丝和孢子的形成，降低病原真菌致病力。麦类作物 应用三唑类杀菌剂防治白粉病至今已有四十多年的历史，白粉病菌对三唑类化合物已产生 抗性在国内外均有研究和报道。三唑类杀菌剂不仅有杀菌作用，还有植物生长调节作用，因 此在使用过程中常有药害发生，影响作物的产量和品质。同时，大量使用化学杀菌剂会对环 境造成污染，并对人畜饮食安全和健康形成潜在的威胁。
[0004] 筛选、培育和种植抗病品种，是防治大麦白粉病的另一重要途径，而发现和鉴定 大麦抗白粉病基因则是抗病育种工作中的重要一环。大麦对白粉病的抗性包括：一，依赖 小种专化抗性抗病基因（如MLA基因）产生的特异性抗性（Shen et al，2007, Science); 二，依赖非小种专化抗性抗病基因（如mlo基因）产生的广谱抗性（Acevedo-Garcia et al，2014, New Phytol.);三，依赖非小种专化抗性抗病基因产生的部分抗性。通过传统育种 方式和分子标记辅助筛选相结合，可以加速将大麦白粉病抗病基因向栽培品种中导入。
[0005] 大麦白粉病菌具有许多生理小种；主栽的大麦抗病品种的白粉病抗性往往与当地 的白粉菌优势生理小种不同，因此不能产生有效的小种专化抗性。而且大麦白粉病菌变异 速度快，使得许多一时有效的小种专化抗性抗病基因在短时间内丧失抗性，成为选育和推 广大麦抗病品种过程中育种工作者一直未能解决的难题。虽然运用mlo基因可以使大麦 对白粉菌产生高效的广谱抗性，但是同时也会加速作物的细胞凋亡、降低作物对其他病害 的防御能力，最终影响作物产量，因此在抗性育种中的应用mlo基因也具有很大的局限性 (Acevedo-Garcia et al, 2014, New Phytol·)。近年来，基因沉默（RNA interference, RNAi) 技术在农作物防治病虫害领域已经获得了广泛的应用（Koch and Kogel, 2014, Plant Biotechnol. J.)，但是过量表达的小RNA所负向调控的靶标基因大多来自有害生物（如病 毒、细菌、真菌、线虫和昆虫等）。
[0006] MicroRNA(miRNA)是一类长度一般约为21个核苷酸的小RNA分子，来源于一条 能够形成茎环结构的单链RNA前体，并能通过碱基的互补配对靶向特异的靶标基因，对该 基因的表达进行负向调控。在植物中，miRNA不仅参与对植株生长发育的调控和对非生物 胁迫的耐受，也参与抵御外界病原菌侵染等生物胁迫过程。miRNA的表达量会在植物与病 原菌的相互作用中发生显著变化，而miRNA合成缺陷突变体对病原菌入侵表现更为敏感， 说明miRNA在植物防御体系中是必要的功能元件，对植物抗病反应具有重要的调控作用 (Weiberg et al, 2014, Annu. Rev. Phytopathol.)。例如在拟南芥中，miR393 革巴向生长素信 号的重要受体TIR1、AFB2和AFB3,抑制生长素的信号传递过程，并增强植物对假单胞菌的 抗性（Navarro et al, 2006, Science)。近年来越来越多的证据表明，miRNA在多种作物针 对多种病原菌的抗病过程中起重要的调节作用。运用microRNA序列调控作物自身基因来 达到防治真菌病害目的的应用性研究尚鲜有报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种与大麦抗白粉病相关的miRNA。
[0008] 本发明的另一目的在于提供该miRNA在提高大麦抗白粉病抗性中的用途。
[0009] 本发明首先发现一种miRNA在白粉菌侵染大麦过程中的表达量发生明显变化， 该miRNA命名为miR167d，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明在接种白粉菌的大 麦叶片样品中利用stem-loop real-time qPCR的方法检测了 miR167d的表达丰度，发现 miR167d的表达量在大麦-白粉菌亲和和非亲和相互作用中均显著升高。
[0010] 因此，本发明提供了与大麦抗白粉病相关的miRNA，其为miR167d，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0011] miR167d前体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 本发明利用psRNATarget分析平台预测了 miR167d在大麦中的革El标基因，发现一 个转录因子ARFl基因可能是miR167d的靶标基因，然后通过烟草共表达实验发现过表达 miR167d可以显著降低ARFl蛋白的积累水平，从而证明了 ARFl的确为miR167d的靶标基 因，而且其表达受miR167d的负向调控。miR167d的靶标基因 ARFl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0013] 含有本发明的与大麦抗白粉病相关的miR167d的表达载体也属于本发明的保护 范围。
[0014] 本发明利用基因枪法在大麦表皮细胞中瞬时过表达miR167d的靶标基因 ARF1， 发现大麦细胞对白粉菌的抗性减低，在非亲和相互作用中尤其显著，表现为白粉菌的吸器 指数显著升高，说明ARFl基因是大麦抗白粉病的负调因子，而负向调控ARFl基因表达的 miR167d可以正向调控大麦对白粉病菌的抗性。
[0015] 进一步地，本发明提供了 miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在负向调 控ARFl基因中的应用。
[0016] 更进一步地，本发明提供了 miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在提尚 植物抗白粉病抗性中的应用。
[0017] 优选地，所述植物为大麦。
[0018] 进一步地，本发明提供了 miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在作物种 质资源改良中的应用。
[0019] 优选地，所述作物为大麦。
[0020] 本发明提供了 miR167d或其表达促进剂或含有其的表达载体在制备转基因大麦 中的应用。
[0021] 本发明提供了用于克隆miR167d的PCR特异性引物对，上游引物如SEQ ID NO. 7 所示，下游引物如SEQ ID NO. 8所示。
[0022] 本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒在筛选培育抗白粉病大麦中的应 用。
[0023] 本发明发现ARFl基因是大麦抗白粉病的负调因子，其过表达能够降低大麦抗白 粉病抗性。
[0024] 因此，本发明还提供了 ARFl基因的过表达在降低大麦抗白粉病抗性中的应用。所 述ARFl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示。
[0025] 本发明还提供了克隆ARFl基因的特异性PCR引物对，其上下游引物的核苷酸序列 分别如SEQ ID NO. 5、6所示。
[0026] 本发明通过对miRNA表达谱的分析，发现miR167d在白粉菌侵染大麦过程中表达 量显著上升，说明miR167d参与大麦防御白粉病菌侵染的过程并发挥生物学功能；本发明 通过在植物中同时过量表达miR167d及其靶标基因 ARFl，发现过量表达miR167d可以明显 抑制ARFl蛋白的积累，说明miR167d靶向ARFl基因并负向调控其表达；通过在大麦表皮细 胞中瞬时过表达miR167d的靶标基因 ARFl基因并接种白粉病菌，发现大麦对白粉病菌的抗 性明显降低，说明miR167d可以增强大麦对白粉菌的抗性。本发明提供的miR167d可广泛 应用于大麦遗传育种、种质资源改良和培育抗白粉病的转基因植物领域，对改进和改良大 麦等作物的种质资源具有重要作用。
【附图说明】
[0027] 图1为白粉菌侵染对大麦miR167d表达水平的影响。用毒性白粉菌小种A6和无 毒白粉菌小种Kl接种遗传背景含有MLAl基因的大麦品种P01，在接种0、4、16、22和48小 时后采集叶片样品，并检测叶片组织中miR167d的相对表达量，进而研究白粉菌侵染对大 麦miR167d表达水平的影响。在此，用毒性白粉菌小种A6接种大麦品种POl可以反映出大 麦对白粉菌的本底抗性，而用无毒白粉菌小种K1接种大麦品种PO 1可以反映出大麦对白粉 菌的小种专化抗性。
[0028] 图2为miR167d与ARFl中靶标位点碱基序列的互补情况。图中显示了 miR167d 核苷酸序列和ARFl基因转录产物mRNA序列中miR167d靶向位点的碱基互补情况，碱基完 全互补以竖杠标示。
[0029] 图3为用