移至I. 5ml离心管中， 1000 Orpm离心5min后，取上清液测定蛋白浓度。每组取30 μ g蛋白进行SDS-PAGE，电泳完 成后转至PVDF膜上，封闭后进行survivin -抗及羊抗兔二抗处理，然后进行化学发光反 应，显影。结果见图6,图6中，Blank为空白对照组，liposome为载双链siRNA分子长循环 阳离子脂质体组，siRNA为双链siRNA分子组。由图6可见，在两种细胞系中，载双链siRNA 分子脂质体相比未包载的双链siRNA分子能显著的降低survivin蛋白的表达，所以本发明 所述的双链siRNA分子可以用于前列腺癌和肺癌的治疗。
[0088] 实施例3 :2' -甲氧基修饰的双链siRNA分子对A549和PC3细胞的抗肿瘤活性实 验
[0089] 1仪器及所用试剂同实施例1
[0090] 2 2' -甲氧基修饰的双链siRNA分子制备
[0091] 对实施例1步骤2制得的双链siRNA分子核苷酸进行2' -糖环的甲氧基修饰，依 据设计思路，对上述双链siRNA分子的正义链3'端的1~10个脱氧核糖分别在不同位点 进行2'-甲氧基修饰，委托广州锐博生物科技有限公司对上述siRNA进行修饰，得到一系列 双链SiRNA分子序列，从中筛选出活性最强的第16位核苷酸序列2'-甲氧基糖环化学修饰 双链siRNA。对得到的该双链siRNA分子序列进行肿瘤细胞增殖及蛋白表达抑制实验。
[0092] 3 MTT法检测第16位核苷酸糖环2' -甲氧基化学修饰的双链siRNA分子对肿瘤 细胞增殖的抑制结果
[0093] 将A549和PC3细胞按每孔IX IO4个接种到96孔细胞培养板中，在37°C、5% CO 2 培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的1640培养基中转染双链siRNA分子，第16 位核苷酸糖环2 '甲氧基修饰双链s iRNA分子，双链s iRNA分子浓度按每孔15nmo I、30nmo 1、 45nmol加入，37°C孵育24小时后，每孔加入20 μ L MTT (5mg/mL)，37°C继续孵育4h，吸除培 养基，加入200 μ L DMSO溶解甲瓒结晶，于490nm处测定吸光度值。计算化学修饰双链siRNA 分子对A549和PC3的抑制作用，结果见图7和图8。在两种细胞系中，第16位核苷酸糖环 2'甲氧基修饰的双链siRNA分子相比未修饰双链siRNA分子能显著杀死A549和PC3肿瘤 细胞，所以本发明所述的双链siRNA分子可以用于前列腺癌和肺癌的治疗。
[0094] 4 Western Blot检测第16位核苷酸糖环2'甲氧基修饰双链siRNA分子对 survivin表达的抑制情况
[0095] 将PC3细胞和A549细胞按每孔I. 6 X IO5个分别接种到6孔细胞培养板中，分别培 养和进行抑制试验，在37°C、5% 0)2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的1640 培养基中，按照RNAiMXTM的说明书转染双链siRNA分子和第16位核苷酸序列2'甲氧基 糖环修饰双链siRNA分子，双链siRNA分子按每孔20nmol加入，37°C孵育48小时后，吸除 培养基，用PBS洗两遍，加入100 μ L细胞裂解液，在冰浴上裂解lOmin，用细胞刮将细胞刮 下，转移至I. 5ml离心管中，1000 Orpm离心5min后，取上清液测定蛋白浓度。每组取30 μ g 蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后转至PVDF膜上，封闭后进行survivin -抗及羊抗兔二抗 处理，然后进行化学发光反应，显影，结果见图9。在两种细胞系中，第16位核苷酸糖环的 2'甲氧基修饰双链siRNA分子（2' -OMe-siRNA)相比未修饰双链siRNA分子能显著的降低 survivin蛋白的表达，因此本发明所述的siRNA可以用于前列腺癌和肺癌的治疗。
【主权项】
1. 一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子，其特征是由具有下述核苷酸序列的 正义链和反义链组成： 正义链 5 , -GGCCCUUGUCUAAGUGCAA-3 ,， 反义链 5 ' -UUGCACUUAGACAAGGGCC-3 '。2. -种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子，其特征是由具有下述核苷酸序列的 正义链和反义链组成： 正义链：5 ' -GGCCCUUGUCUAAGUGCAA XX-3 '， 反义链：5 , -UUGCACUUAGACAAGGGCC MN-3 ,; 其中，XX为dTdT、TT或UU。M和N分别独立为C、G、A、U、dC、dG、dA或dT ;C代表胞嘧 啶核糖核苷酸、G代表鸟嘌呤核糖核苷酸、A代表腺嘌呤核糖核苷酸、T代表胸腺嘧啶核糖核 苷酸、U代表尿嘧啶核糖核苷酸、dC代表胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、dG代表鸟嘌呤脱氧核糖核 苷酸、dA代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、dT代表脱氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。3. 权利要求1或2所述的双链siRNA分子在制备抑制细胞survivin基因表达试剂中 的应用。4. 权利要求1或2所述的双链siRNA分子在制备抑制细胞survivin蛋白表达试剂中 的应用。5. 根据权利要求3或4中所述的应用，其特征在于：所述细胞是survivin高表达的肿 瘤细胞。6. -种siRNA表达质粒，其特征在于，所述质粒是包含权利要求1~2任一项所述双链 siRNA分子。7. -种Survivin基因沉默试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1~2任一 项所述的双链siRNA分子或权利要求6所述的siRNA表达质粒。8. 权利要求1~2任一项所述的抑制survivin基因表达的双链siRNA分子或权利要 求6所述的siRNA表达质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 包载权利要求1或2所述双链siRNA分子的传递体，所述传递体为病毒载体或非病 毒载体形式。10. 根据权利要求9所述的双链siRNA分子的传递体，其特征在于：所述病毒载体为含 有所述双链siRNA分子的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒载体中的至少一种；所 述非病毒载体为含有所述双链siRNA分子的脂质体、纳米粒、细胞渗透性多肽、靶向融合蛋 白中的至少一种。11. 一种末端修饰的双链siRNA分子，其特征在于：对权利要求1或2所述双链siRNA 的核苷酸序列的3'突出端用磷酸二酯基团取代硫代磷酸酯键。12. -种末端修饰双链siRNA分子，其特征在于：在权利要求1或2所述双链siRNA分 子的核苷酸序列的3'末端及末端少量核苷酸序列中核苷酸进行化学修饰，包括在3'末端 核苷酸糖环的2'位点引入甲氧基、甲氧乙基、氟基及烷氧基中的一种或多种：3'末端被修 饰核苷酸数目为1~10个，化学修饰数目为1~10个。13. -种3'末端核苷酸糖环的2' -甲氧基修饰双链siRNA分子，其特征在于：在权利 要求1或2所述双链siRNA分子序列，在该序列的第16位核苷酸酸序列上进行核苷酸糖环 的2' -甲氧基修饰。14. 权利要求11~13中任一项所述的双链siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。15. 根据权利要求14中所叙述的应用，其中肿瘤是乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病、胃癌、 宫颈癌、膀胱癌、皮肤鳞癌、口腔上皮癌、结直肠癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、黑色 素瘤或骨肉瘤中至少一种。
【专利摘要】本发明公开了一种涉及抑制survivin基因表达的siRNA序列，其是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链5＇-GGCCCUUGUCUAAGUGCAA-3＇，反义链5＇-UUGCACUUAGACAAGGGCC-3＇。具有广谱的siRNA抗肿瘤作用，对乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肠癌、肝癌、白血病、胃癌、宫颈癌、口腔上皮癌等在体外都有良好的抑制作用，尤其是对肺癌、前列腺癌细胞。
【IPC分类】A61K48/00, A61P35/02, A61P35/00, C12N15/85, A61K31/713, C12N15/113
【公开号】CN105176999
【申请号】
【发明人】滕乐生, 郝斐, 李剑光, 谢晶, 孟庆繁, 逯家辉, 刘艳, 刘洋, 权宇彤
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月13日