位核苷酸糖环的2'甲氧基化学修饰在该双链siRNA分子序列上进行。
[0059] 3.沉默效率的验证
[0060] 3. 1细胞培养：A549肺癌细胞和PC3前列腺癌细胞分别在含10 % FBS的1640培 养基中，37 °C、5 % CO2培养箱培养。
[0061] 3. 2细胞铺板并转染：将3. 1培养的A549肺癌细胞和PC3前列腺癌细胞按每孔 I X IO4个接种到24孔细胞培养板中分别进行细胞培养和之后的试验，在37°C、5 % CO 2培养 箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的1640培养基中，按照RNAiMAX?的说明书转染， 双链siRNA分子按每孔20nmol加入。同时用转染试剂RNAiMAX?将阴性对照NT-siRNA分 别转入A549和PC3细胞。
[0062] 3. 3实时定量PCR检测survivin基因 mRNA水平：用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNAkit提取纯化上述经过转染的癌细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用 每孔90 μ L无 RNase水溶解RNA，取5 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。
[0063] 用基因特异性引物检测样本中survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系：5 μ L模板RNA， 15 yL 2XSensiMix one-st 印，I yL 5 '正向引物（6 μΜ)，0· 6 yL 50XSYBR Green I，用 无 RNase水补足体系至25 μ L。反应条件：40°C反转录30min，95°C预变性5min，95°C变性 30sec，6CTC 退火 30sec，72°C延伸 40sec，循环 40 次。
[0064] 3. 4结果分析：利用实时定量PCR分析实验结果，并作出柱状图，实验分为四组，其 中未转染组为未经任何处理的细胞样品，NT-siRNA为浓度30nmol的阴性对照，其他两组为 本发明实施例1步骤2合成的双链siRNA分子，浓度分别为15nm〇l、30nm〇l。如图1所示， 结果显示革El向survivin基因的双链siRNA分子沉默效果显著并具有一定的浓度依赖性。在 双链siRNA分子为30nmol时，survivin基因的沉默效率即可达到80%以上。
[0065] 4. Western Blot检测双链siRNA分子对survivin表达的抑制情况
[0066] 将PC3细胞和A549细胞按每孔I. 6 X IO5个分别接种到6孔细胞培养板中分别培 养，分别进行抑制试验，在37°C、5% 0)2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的 1640培养基中，按照RNAiMAXTM的说明书转染，实施例1步骤2合成的siRNA按每孔20nmol 加入，37°C孵育48小时后，吸除培养基，用PBS洗两遍，加入100 μ L细胞裂解液，在冰浴上 裂解lOmin，用细胞刮将细胞刮下，转移至I. 5ml离心管中，1000 Orpm离心5min后，取上清 液测定蛋白浓度。每组取30 μ g蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后转至PVDF膜上，封闭后进行 survivin -抗及羊抗兔二抗处理，然后进行化学发光反应，显影。结果见图2,在两种细胞 系中，双链siRNA分子都能显著的降低survivin蛋白的表达，所以本发明所述的双链siRNA 分子可以用于前列腺癌和肺癌的治疗。
[0067] 5. MTT法检测双链siRNA分子对肿瘤细胞增殖的抑制结果
[0068] 将PC3细胞和A549细胞按每孔I X IO4个接种到96孔细胞培养板中，在37°C、5% 〇)2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的1640培养基中，按照RNAiMAXTM的说 明书转染，实施例1步骤2中合成的双链siRNA分子分别按每孔15nmol、30nmol、45nmol加 入，37°C孵育48小时后，每孔加入20 yLMTT(5mg/mL)，37°C继续孵育4h，吸除培养基，加入 200 μ L DMSO溶解甲瓒结晶，于490nm处测定吸光度值。结果见图3,在两种细胞系中，双链 siRNA分子都能显著杀死A549和PC3肿瘤细胞，所以本发明所述的双链siRNA分子可以用 于前列腺癌和肺癌的治疗。
[0069] 实施例2 :包载双链siRNA分子的阳离子脂质体对A549和PC3细胞的抗肿瘤活性 实验
[0070] 1 试剂
[0071] 二油酰磷脂酰乙醇（1，2-Dioleoyl-sn-Glycer〇-3-Phosphoethanolamine， DOPE)(德国lipoid公司），胆固醇，甲氧基化聚乙二醇2000二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE-mPEG2000)(德国lipoid公司），氯仿，蔗糖（中国医药集团上海化学试剂公司）， DOTAP (Biontex，德国）
[0072] 2 仪器
[0073] LF-I型薄膜挤出器：加拿大AVESTIN公司
[0074] N-1001D-WA旋转蒸发器：日本东京理化
[0075] Y92- II N超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司
[0076] -80°C低温冰箱：美国REVCO公司
[0077] Milli-QUFPLUS 纯水仪：美国 Millipore 公司
[0078] 高压灭菌锅TH-3560 :造鑫（鑫科）企业有限公司
[0079] 3包载双链siRNA分子的脂质体制备
[0080] 3. 1空白阳离子脂质体的制备
[0081] 精密称取DOPE、DOTAP和DSPE-mPEG2000按摩尔比例（5 :2 :0. 25)溶于一定体积 氯仿，37°C水浴减压蒸发，除去氯仿，得到干燥的脂质薄膜后，加入一定体积的10%蔗糖溶 液轻摇，将脂质薄膜从瓶壁洗下，即得乳白色脂质混悬液，使充分水合后，水浴超声处理至 溶液呈半透明，然后通过薄膜挤压器过IOOnm聚碳酸酯膜，各11遍，即得长循环空白阳离子 脂质体。
[0082] 3. 2包载双链siRNA分子的脂质体制备
[0083] 将长循环空白阳离子脂质体与含siRNA的缓冲液按5:1正负电荷比混匀，放置 30min，形成载双链siRNA分子长循环阳离子脂质体，全程采用siRNA专用缓冲液及无酯酶 水稀释，避免双链siRNA分子降解。
[0084] 4 MTT法检测包载双链siRNA分子脂质体对肿瘤细胞增殖的抑制结果
[0085] 将A549和PC3细胞按每孔I X IO4个分别接种到96孔细胞培养板中分别进行培养 和进行抑制试验，在37°C、5% 0)2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的1640培 养基中转染步骤3制得的载双链siRNA分子长循环阳离子脂质体（以下简称载双链siRNA 分子脂质体），载双链siRNA分子脂质体按每孔15nm〇l、30nm〇l、45nm 〇l加入，37°C孵育48 小时后，每孔加入20 μ L MTT (5mg/mL)，37°C继续孵育4h，吸除培养基，加入200 μ L DMSO溶 解甲瓒结晶，于490nm处测定吸光度值。计算载双链siRNA分子脂质体对Α549和PC3的抑 制作用，结果见图4和图5。在两种细胞系中，脂质体包载双链siRNA分子相比双链siRNA 分子组能显著杀死A549和PC3肿瘤细胞，所以本发明所述的双链siRNA分子可以用于前列 腺癌和肺癌的治疗。
[0086] 5 Western Blot检测包载双链siRNA分子脂质体对survivin表达的抑制情况 [0087] 将PC3细胞和A549细胞按每孔I. 6 X IO5个分别接种到6孔细胞培养板中分别培 养和进行抑制试验，在37°C、5% 0)2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的1640 培养基中，按照RNAiMXTM的说明书转染双链siRNA分子和载双链siRNA分子脂质体，双 链siRNA分子按20nmol每孔加入，37°C孵育48小时后，吸除培养基，用PBS洗两遍，加入 100 μ L细胞裂解液，在冰浴上裂解lOmin，用细胞刮将细胞刮下，转