设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的 优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反 应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
[0034] 二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR 产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即 毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；
[0035] 三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂 盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可以更好地确保检测结果的准确性。
【附图说明】
[0036] 图1为临床样品CYP3A5*3野生型的焦磷酸测序图；
[0037] 图2为临床样品CYP3A5*3突变杂合型的焦磷酸测序图；
[0038] 图3为临床样品CYP3A5*3突变纯合型的焦磷酸测序图；
[0039] 图4为临床质控品control oligo的焦磷酸测序图；
[0040] 图5为临床空白对照品的焦憐酸测序图；
[0041] 图6至图8为多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图6及图7的测序结果均不准 确，只有图8的测序结果真实可靠。
【具体实施方式】
[0042] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对 本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0043] 实施例1 :试剂盒的制备
[0044] 一、引物和探针的设计与合成
[0045] 研究表明针对人CYP3A5基因检测的多态性位点CYP3A5*3,选择特异的突变位点， 使用PyroMark Assay Design 2.0软件，设计引物；其中正向扩增引物、反向扩增引物和测 序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID NO. 1的5'为生物素标记。
[0046] 表1.突变位点与类型：
[0048] 扩增序列如表2:
[0049] 表2.特异性扩增引物及引物序列
[0052] 二、对照品选择
[0053] 使用人工合成的一段寡聚核苷酸链TAYGGTTTGCA contro 1 〇 I i go为质控品； DNase/RNase-free水为空白对照品。
[0054] 三、PCR反应液组成
[0055] 表3. PCR反应液组成
[0057] 实施例2 :试剂盒的使用
[0058] -、样品检测
[0059] 溶解引物干粉（引物溶解后有效期为1个月）。按照模板数配制体系：取PCR反 应液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对 照品或阳性对照品为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。
[0060] CYP3A5*3体系各主要成分如下：
[0061] 表4. CYP3A5*3体系各主要成分
[0064] 该体系反应程序如下：
[0065] 表5. PCR反应程序
[0066] CN 105176991 A 说明书 6/7 页
[0067] 扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验PCR结果，以进行下一步程序。
[0068] 二、焦磷酸测序
[0069] 按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然 后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的混合液中上机测序。焦磷酸测序仪试剂 仓中加入运行程序相应的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。质控品contro 1 oligo (自带测序引物），最终浓度为0· 04 μ M。
[0070] 三、结果判断
[0071] 质控品喊基检出率为100% ;空白对照品检出率为0。
[0072] 四、质控标准
[0073] 各类对照质控品判断结果如下表：
[0074] 表6.质控品标准检测结果
[0076] 五、结果报告：
[0077] 结果如图1、图2及图3所示，样品结果的判断标准如下：
[0078] 表7.报告样品检测结果
[0080] 图1显示的是临床样品检测结果中CYP3A5*3的野生型，图2显示的是临床样品检 测结果中CYP3A5*3的突变杂合型，图3显示的是临床样品检测结果中CYP3A5*3的突变纯 合型；图4及图5分别显不的是临床检测结果中的质控品control oligo和空白对照品的 焦磷酸测序图，图6至图8显示的是设计的多组引物的焦磷酸测序效果图，其中图8的引物 为最佳（CYP3A5*3，G = 55%，A = 45% )，是我们产品中选定的引物。
[0081] 本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒具有以下有 益效果：
[0082] -、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的 优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反 应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
[0083] 二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR 产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即 毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；
[0084] 三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂 盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可以更好的确保检测结果的准确性。
[0085] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包 括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对，其特征在于，所述CYP3A5基因检 测的多态性位点为CYP3A5*3,所述引物对包括： 正向扩增引物：5 ' -AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3 ' ； 反向扩增引物：5' -CAGGAAGCCAGACTITGATCAIT-3' ； 测序引物：5' -CCAAACAGGGAAGAGATA-3' ； 其中，所述正向扩增引物的5'端进行生物素标记。2. -种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的试剂盒，其特征在于，所述CYP3A5基因检 测的多态性位点为CYP3A5*3,所述试剂盒包括： 正向扩增引物：5 ' -AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3 ' ； PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5' -CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3' ； 测序引物：5' -CCAAACAGGGAAGAGATA-3' ； 其中，所述正向扩增引物的5'端进行生物素标记。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括： CYP3A5*3阳性对照品1，其为插有SEQIDNO. 5所示核苷酸序列的CYP3A5*3野生纯合 子质粒； CYP3A5*3阳性对照品2,其为所述CYP3A5*3野生纯合子质粒与插有SEQIDNO. 6所示 核苷酸序列的CYP3A5*3突变纯合子质粒组成的质粒混合物； CYP3A5*3阳性对照品3，其为插有SEQIDNO. 6所示核苷酸序列的CYP3A5*3突变纯合 子质粒； 其中，质粒载体为pMD18-T质粒。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP3A5*3阳性对照品2中所述 CYP3A5*3野生纯合子质粒和所述CYP3A5*3突变纯合子质粒的数量比为1: 1。5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：质控品和空白对照 品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。7. 权利要求1所述的引物对在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的应用。8. 权利要求2所述的试剂盒在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物及测序引物，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记；所述试剂盒包括正向扩增引物、含有反向扩增引物的PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105176991
【申请号】
【发明人】滕祥云, 陈艳
【申请人】长沙三济生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月18日