焦磷酸测序法检测cyp3a5基因分型的引物对及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基 因分型的引物对及试剂盒。
【背景技术】
[0002] CYP3A是CYP超家族中在肝脏和肠道表达最为丰富的酶，可占到整个CYP酶系的 30%-70%。CYP3A广泛分布于人体胃肠道、胎盘、子宫、肾等组织中。在人体内的CYP3A有 CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7及CYP3A3共4种亚型。CYP3A的四个成员串联排列在7q22. 1上 长约231kb的基因座内。其各成员在发育模式、分布特征、含量及活性等方面有所不同。但 氨基酸序列相似度高达75% -88%，而且在底物谱、催化反应及转录调控等方面相互重叠。 〇丫卩345只在10%-20%的成人中存在，细胞色素？450酶系34亚家族参与约60%的处方药 物代谢，而其主要成员CYP3A4和CYP3A5则共同参与约50%的临床用药的代谢。
[0003] CYP3A5位于人类7号染色体q21. 1-22. 1，基因全长为31.8kb，有13个外显子， 编码502个氨基酸，它的表达及活性有着很大的个体和种族差异，在成年人中，只有约 10% -20%的少数人表达较多的CYP3A5,在这些人群中，CYP3A5可占肝脏总CYP3A酶含量 的50%以上，因此CYP3A5的表达是决定个体间药物疗效和个体间药物毒性差异的最重要 因素。
[0004] CYP3A5活性的差异主要由单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism， SNP)造成。迄今为止，已从人群中筛查出26个CYP3A5基因变异，多数频率较低，且无显著 的功能改变。其中，最为重要的是3号内含子的由腺嘌呤（A)突变为鸟嘌呤（G)的单碱基 突变（CYP3A5*3)。CYP3A5*3产生数种剪接变异体mRNA，使终止密码子提前，导致CYP3A5缺 乏。CYP3A5*3/*3基因型（GG基因型）不表达CYP3A5,只有CYP3A5*l/*3基因型（AG基因 型）或CYP3A5*1/*1基因型（AA基因型）才能产生高水平mRNA，进而表达CYP3A5。即，只 有至少含有一个CYP3A5*1时才能表达高水平CYP3A5。
[0005] CYP3A5*3是中国人群最常见的SNP，在中国汉族、维吾尔族及哈萨克族的发生频 率分别为72. 7%，84. 8%和86. 6%，而高加索人群为91. 7%。
[0006] CYP3A5活性的改变可以改变以其为底物的药物的药代动力学。近年来，关于 CYP3A5*3 (6986A/G)多态性和药物血药浓度、疗效的相关性研究成为热点。研究发现，服用 西罗莫司的肾移植患者中，基因型为CYP3A5*1/*1或CYP3A5*l/*3的患者需要更大的日剂 量才能达到和基因型为CYP3A5*3/*3的患者一样的西罗莫司稳态血药浓度。研究报道，携 带CYP3A5*1的患者较CYP3A5*3纯合子患者有更高的他克莫司清除率。此外，国内最近一 项研究表明，与携带CYP3A5*1等位基因 AA患者相比，CYP3A5*3/*3基因型患者口服较低剂 量环孢菌素 A就能达到相当的服药后2h血药浓度水平。以往的研究还证明，CYP3A5的基 因型对氨氯地平、沙奎那韦、阿普唑仑的代谢有影响；但同为CYP3A底物的咪达唑仑、硝苯 地平、地尔硫卓、氯吡格雷的代谢不受CYP3A5基因型的影响。
[0007] CYP3A5*3多态性是唯一对肾移植受体他克莫司（FK506)起始用量具有明确指导 意义的基因多态性。体外研究显示，在他克莫司代谢过程中，CYP3A5是较CYP3A4更为有效 的酶，对他克莫司代谢的贡献率达60%，催化效率是CYP3A4的1. 64倍。以CYP3A5基因型 作为免疫抑制剂个体化治疗的依据，有助于确定他克莫司用药的初始剂量，变被动的监测 为主动的预测，能有效降低移植术后急性排斥反应（AR)的发生率和药物的毒性及不良反 应，进一步提高移植器官的存活率。
[0008] 综上所述，对患者进行CYP3A5基因分型检测，具有极其重要的临床意义。检测 CYP3A5酶对药物代谢速率的快、慢，合理调整药物剂量，提高临床治疗中药物疗效及降低毒 副反应发生概率；指导临床正确使用环孢霉素及他克莫司等药物，减少用药无效的情况。
[0009] 焦磷酸测序（Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序方法（即，确定 DNA中核苷酸的顺序），属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析 的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催 化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若 该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团 (PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度 与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分 析出峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术 检测CYP3A5基因分型的产品。
[0010]目前，现有技术中，主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)、手工或自动测序及序列特异性引物PCR等方法检测CYP3A5基因分型，这些方 法存在检测结果准确性不高、检测周期长及操作繁琐的缺点，难以满足临床检验的标准要 求。
【发明内容】
[0011] 为了解决上述方法检测CYP3A5基因分型过程中存在检测结果准确性不高、检测 周期长、操作繁琐及难以满足临床检验要求的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、特 异性高、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的焦磷酸测序法检测CYP3A5基因 分型的引物对及试剂盒。
[0012] 本发明提供了一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对，所述CYP3A5基 因检测的多态性位点为CYP3A5*3,所述引物对包括：
[0013] 正向扩增引物：5' -AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3'（SEQ ID NO. 1);
[0014] 反向扩增引物：5'-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3'（SEQ ID NO. 2);
[0015] 测序引物：5' -CCAAACAGGGAAGAGATA-3'（SEQ ID NO. 3);
[0016] 其中，所述正向扩增引物的5'端进行生物素标记。
[0017] 本发明还提供了一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的试剂盒，所述CYP3A5 基因检测的多态性位点为CYP3A5*3,所述试剂盒包括：
[0018] 正向扩增引物：5' -AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3'（SEQ ID NO. 1);
[0019] PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5'-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3 '（SEQ ID NO. 2);
[0020] 测序引物：5' -CCAAACAGGGAAGAGATA-3'（SEQ ID NO. 3);
[0021] 其中，所述正向扩增引物的5'端进行生物素标记。
[0022] 在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：
[0023] CYP3A5*3阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的CYP3A5*3野生 纯合子质粒；
[0024] CYP3A5*3阳性对照品2,其为所述CYP3A5*3野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO. 6 所示核苷酸序列的CYP3A5*3突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
[0025] CYP3A5*3阳性对照品3,其为插有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的CYP3A5*3突变 纯合子质粒；
[0026] 其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述CYP3A5*3阳性对照品2中所述CYP3A5*3野 生纯合子质粒和所述CYP3A5*3突变纯合子质粒的数量比为1:1。
[0027] 在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品 (controloligo)和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA(SEQIDNα4) ;所 述空白对照品为水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测 PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。
[0028] 所述PCR反应液还含有其他组份，分别为常规的10 X PCR Buffer、dNTPs和H2O,各 组份按常规体积比配置（10XPCR Buffer、dNTPs、H20及PCR反应液中反向扩增引物的体积 比为 5 :3 :37. 5 :1)。
[0029] 所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚 合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5' -磷酰硫酸和荧光 素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
[0030] 本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的 应用。
[0031] 本发明还提供了如上所述的试剂盒在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的 应用。
[0032] 相较于现有技术，本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及 试剂盒具有以下有益效果：
[0033] -、通过利用焦磷酸测序法技术