。用 IOml原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在0. 5ml感受态 中加入适量DNA于37°C、200rpm振荡培养30min后涂板，再在37°C培养过夜，次日检查和验 证转化子。
[0040] 实施例2利用易错PCR方法构建碱性蛋白酶突变体文库
[0041] 2.1 易错 PCR
[0042] 利用易错PCR的技术在体外向克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii)的碱 性蛋白酶aprE基因中引入核苷酸突变，易错PCR的反应条件为：10 X PCR Buf fer (不 含 MgCI2)5yL，dCTP(25mmol/L)2yL，dTTP(25mmol/L)2yL，dGTP(10mmol/L)lyL， dATP(10mmol/L) I μ L，F(10pmol/ μ L) I μ L，R(10pmol/ μ L) I μ L，Mg2+(20mM) 14 μ L， Mn2+ (3mM) I. 5 μ L，pQC67 0· 5 μ L，Taq DNA polymerase (2. 5U) I μ L，ddH20 20 μ L0
[0043] 弓5 _tagttcatcgatcgcatcggctgctgaagaagcaaaagaaaaat_3'
[0044] 弓丨物 6 :5' -atttttcttttgcttcttcagcagccgatgcgatcgatgaacta-3'
[0045] 以引物5及引物6分别为上游引物和下游引物，扩增条件为：94°C IOmin ; 94Γ 60s，58Γ 60s，72°C 2min，30 个循环；72°C 10min。利用 Ε· Ζ· Ν· A. Gel Extraction Kit 回收PCR扩增产物。
[0046] 2· 2含突变体表达载体构建
[0047] 以pQC67质粒为模板，利用引物1和引物6进行PCR扩增，获得载体基因序列。 扩增条件为：98°C IOmin ;98°C 10s，55°C 20s，72°C 3min，30 个循环；72°C 10min。利用 Ε· Ζ· N. A. Gel Extraction Kit 回收 PCR 扩增产物。
[0048] 将aprE基因片段和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如下： 5 X Phusion HF Buffer 10 μ L，2. 5mM dNTPs 8 μ L，Insert gene (aprE 片段）4yL， Linearized vector(pQC67)6yL，Phusion DNA Polymerase I yL，ddH20 21 yL。扩增条件 为98。(：1〇111丨11;98。(：1〇8,721€3111丨11，20个循环 ；98。(：1〇8,721€6111丨11，15个循环；72。(：1〇11^11。
[0049] 将多聚体转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，得到阳性转化子，即为能表达碱 性蛋白酶突变体的重组菌株。同时再以突变体为模板，进行多轮易错PCR，构建更多碱性蛋 白酶突变体文库。
[0050] 实施例3碱性蛋白酶突变体的筛选
[0051] 3.1 96孔板初筛
[0052] 将实施例2获得的表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株分别接种于若干2mL圆底96 孔板加入600 μ L种子培养基（酵母浸粉0. 5 %，胰蛋白胨0. 5 %，葡萄糖1 %，K2HPO4 1. 8 %， 卡纳霉素25 μ g/mL)中，34°C、210rpm振荡培养8h ;以5 %转接量接种至96孔板产酶培养 基（酵母粉1~2 %，豆饼粉2~5 %，麦芽糊精5~10 %，柠檬酸钠0. 1~0. 5 %，CaCl20.1~0.5%，]\%504 0.1 ~0.5%，1(2册04 0 . 5 ~2%)中，34°(：、250邝111振荡培养3611;采 用Freedom EV0200-8MCA96高通量微生物筛选工作站（购自瑞士 Tecan公司）进行酶活测 定，同时，接种枯草芽孢杆菌BS作为对照。最终申请人共筛选到12株在中性pH范围（即 PH7-9)内发酵液酶活力显著高于枯草芽孢杆菌BS的菌株，并将其分别命名为枯草芽孢杆 菌 BS-l，BS-2，......，BS-12。
[0053] 3· 2摇瓶发酵
[0054] 将上述筛选到的12株菌株（BS-l，BS-2,……，BS-12)和对照菌枯草芽孢杆菌BS， 分别接种于50mL种子培养基（酵母浸粉0. 5 %，胰蛋白胨0. 5 %，葡萄糖1 %，K2HPO4 1. 8 %， 卡纳霉素25 μ g/mL)中，34°C、210rpm振荡培养8h。然后分别取2. 5mL发酵液接种到50mL 发酵培养基（酵母粉1~2 %，豆饼粉2~5 %，麦芽糊精5~10 %，柠檬酸钠0. 1~0. 5 %， 〇&(：120.1~0.5%，]\%504 0.1 ~0.5%，1(2册04 0 . 5 ~2%)中，34。(：、250邝111振荡培养7211;离心取上清液。
[0055] 3. 3酶活测定
[0056] 采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法（GB/T 25327-2009)，在 pH7. 0条件下，分别检测上述12株菌株（BS-1，BS-2，……，BS-12)和对照菌枯草芽孢杆 菌BS发酵上清液的碱性蛋白酶酶活，其中酶活水平最高的菌株分别为枯草芽孢杆菌BS-4， BS-5, BS-10,其发酵上清液酶活分别为4549U/mL、9073U/mL和7333U/mL，与对照菌枯草芽 孢杆菌BS相比，分别提高了 42%、180%和130%。
[0057] 实施例4碱性蛋白酶突变体序列的确定
[0058] 利用TIAN GEN公司的TIANr印Rapid Mini Plasmid Kit试剂盒，分别提取枯草 芽孢杆菌BS-4，BS-5,BS-10中的质粒；然后利用实施例1中所述引物3和引物4,由华大基 因公司对上述质粒分别进行基因测序。
[0059] 测序结果显示：枯草芽孢杆菌BS-4中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸 序列为SEQ ID N0:4,其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:3,申请人将该碱性蛋白酶命名 为aprE-Ml ;枯草芽孢杆菌BS-5中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:6,其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:5,申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M2;枯草芽 孢杆菌BS-10中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:8,其编码的氨基 酸序列为SEQ ID NO:7,申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M3。
[0060] 进一步，申请人将上述获得的碱性蛋白酶aprE-Ml、aprE-M2和aprE-M3的氨基酸 序列分别与野生型碱性蛋白酶aprE的氨基酸序列SEQ ID NO: 1进行对比分析。结果显示： 与野生型碱性蛋白酶aprE相比，碱性蛋白酶aprE-Ml的第103位氨基酸由Ser突变为Glu ; 碱性蛋白酶aprE-M2的第103位氨基酸由Ser突变为Glu，第132位氨基酸由Thr突变为 Asp ;碱性蛋白酶aprE-M3的第103位氨基酸由Ser突变为Glu，第207位氨基酸由Thr突 变为Arg。
[0061 ] 实施例5碱性蛋白酶突变体酶学性质分析
[0062] 采用 pH 分别为 7·0、7·5、8·0、8·5、9·0、9·5、10·0、10·5、11·0、11·5 和 12.0 的缓 冲液稀释上述枯草芽孢杆菌BS-4 (重组表达碱性蛋白酶突变体aprE-Ml)，BS-5 (重组表达 碱性蛋白酶突变体aprE-M2)、BS-10 (重组表达碱性蛋白酶突变体aprE-M3)和对照菌枯草 芽孢杆菌BS (重组表达野生型碱性蛋白酶aprE)的发酵上清液，在30°C条件下分别检测其 碱性蛋白酶酶活，以每株菌发酵上清液的最高酶活计100%，分别计算相对酶活，做PH-相 对酶活曲线。结果如图2所示，野生型碱性蛋白酶aprE的最适pH为11. 5,而本发明获得 的碱性蛋白酶突变体aprE-Ml、aprE-M2和aprE-M3的最适pH分别为10. 5,9. 0和10. 0,且 在pH7. 0-9.0的范围内相对酶活显著高于野生型碱性蛋白酶，其中又以碱性蛋白酶突变体 aprE-M2的相对酶活最高，取得了意料不到的技术效果。
[0063] 综上，本发明运用易错PCR技术获得了三个碱性蛋白酶突变体，与野生型相比，突 变体的最适pH普遍向中性条件偏移，且在pH7. 0-9. O的范围酶活得到显著提高，可广泛应 用于中性洗涤剂中，有利于减少洗涤剂对皮肤、衣物等的损伤，市场前景广泛。
【主权项】
1. 一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ IDN0:3〇2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQIDN0:4。4. 一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体是权利要求1所述 的碱性蛋白酶突变体的第132位氨基酸由Thr突变为Asp，其氨基酸序列为SEQIDNO: 5。5. -种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体是权利要求1所述 的碱性蛋白酶突变体的第207位氨基酸由Thr突变为Arg，其氨基酸序列为SEQIDNO: 7。6. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求4或5所述的碱性蛋白酶突变体。7. 如权利要求6所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQIDN0:6或 SEQIDNO:8。8. -种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有编码权利要求1、4或5 所述的碱性蛋白酶突变体的基因。9. 一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染有权利要求8所 述的重组表达载体的宿主细胞。10. 如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)〇
【专利摘要】本发明提供一种新型的碱性蛋白酶突变体，以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过易错PCR技术获得了三个碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌BS-4，BS-5和BS-10，其发酵上清液在pH7.0条件下的酶活分别为4549U/mL、9073U/mL和7333U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的枯草芽孢杆菌BS分别提高了42％、180％和130％。此外，所述野生型碱性蛋白酶aprE的最适pH为11.5，而本发明获得的碱性蛋白酶突变体aprE-M1、aprE-M2和aprE-M3的最适pH分别为10.5，9.0和10.0，且在pH7.0-9.0的范围内相对酶活显著高于野生型碱性蛋白酶，其中又以碱性蛋白酶突变体aprE-M2的相对酶活最高，取得了意料不到的技术效果。
【IPC分类】C12N15/57, C12N15/75, C12R1/125, C12N9/54, C12N1/21
【公开号】CN105176951
【申请号】
【发明人】石增秀, 付娟, 吴秀秀, 齐建, 徐玉婷, 郭小飞
【申请人】青岛蔚蓝生物集团有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月4日