一种新型碱性蛋白酶突变体的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质工程改造领域，具体涉及一种新型的碱性蛋白酶突变体。
【背景技术】
[0002] 碱性蛋白酶（alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的 酶类，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27kDa。国内工业生 产蛋白酶的菌株多是经地衣芽孢杆菌2709选育而来，是通过深层发酵、提取及精制而成 的一种蛋白水解酶。碱性蛋白酶广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业 用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60%左右（Mala B.R.等，1998， Microbiology and Molecular Biology Reviews)〇
[0003] 酶分子的定向进化，是模拟自然进化过程的人工策略，属于蛋白质的非合理设计 方式，通过利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，迅速获得理想的突变体。近 几年酶的定向进化主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立 体选择等方面（Johannes TW et al. Curr. Microbiol, 2006, 9:261-267)。酶的定向进化技 术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。
[0004] 碱性蛋白酶是目前市场上畅销的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤剂的去污效果， 特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果。市场上现有的碱性蛋白 酶产品普遍在碱性（PH9-12)条件下的活力较高，洗涤效果好，而在中性（pH7-9)条件下的 活力较低。但是碱性洗涤剂对皮肤、衣物等的损伤较大，因此目前急需开发一种在中性条件 下仍能保持高酶活力的碱性蛋白酶产品。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决现有技术问题提供了一种在中性pH范围内酶活力得到显著提高的 碱性蛋白酶突变体。所述突变体是由克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii)碱性蛋白酶基 因 aprE的成熟肽出发，运用易错PCR分子生物学技术获得的。
[0006] 本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的碱 性蛋白酶的第103位氨基酸由Ser变为Glu。
[0007] 上述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:3,其一种编码基因的核酸序 列为 SEQ ID NO:4。
[0008] 本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID N0:4的碱性蛋白酶突变体基因的质粒。
[0009] 本发明另一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID N0:3的 碱性蛋白酶的第132位氨基酸由Thr突变为Asp。
[0010] 上述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:5,其一种编码基因的核酸序 列为 SEQ ID NO:6。
[0011] 本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID N0:6的碱性蛋白酶突变体基因的质粒。
[0012] 本发明还提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:3的碱性蛋 白酶的第207位氨基酸由Thr突变为Arg。
[0013] 上述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID N0:7,其一种编码基因的核酸序 列为 SEQ ID NO:8。
[0014] 本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID N0:8的碱性蛋白酶突变体基因的质粒。
[0015] 本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0016] 所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。
[0017] 本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过易错PCR技术获 得了三个碱性蛋白酶突变体aprE-Ml、aprE-M2和aprE-M3，并分别构建了表达上述突变体 的重组菌枯草芽孢杆菌BS-4, BS-5和BS-10,其发酵上清液在pH7. 0条件下的酶活分别为 4549U/mL、9073U/mL和7333U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的枯草芽孢杆菌BS 分别提高了 42%、180%和130%。此外，所述野生型碱性蛋白酶aprE的最适pH为11. 5， 而本发明获得的碱性蛋白酶突变体aprE-Ml、aprE-M2和aprE-M3的最适pH分别为10. 5， 9. 0和10. 0,且在pH7. 0-9. 0的范围内相对酶活显著高于野生型碱性蛋白酶，其中又以碱性 蛋白酶突变体aprE-M2的相对酶活最高，取得了意料不到的技术效果。本发明所述碱性蛋 白酶突变体可广泛应用于中性洗涤剂中，有利于减少洗涤剂对皮肤、衣物等的损伤，市场前 景广泛。
【附图说明】
[0018] 图I :pQC67质粒的遗传图谱；
[0019] 图2 :碱性蛋白酶突变体pH-相对酶活曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更 好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方 法步骤。
[0021] 对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：
[0022] 1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法 (GB/T 25327-2009)〇
[0023] 2、酶活单位的定义：Ig固体酶粉（或ImL液体酶），在一定温度和pH值条件下， Imin水解酪蛋白产生1 μ g酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
[0024] 3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液 (一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42. 4g/L)，三氯乙酸（65. 4g/L)， 梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0 g/L)。反应过程如下：试管中加入ImL酶液，40°C温浴 2min，加入酪蛋白溶液lmL，摇匀后40°C温浴lOmin，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对 照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止lOmin，慢速定性滤纸过滤。取ImL滤 液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液lmL，40°C显色20min，于680nm波长，用IOmm比 色皿测定吸光度。
[0025] 4、定义：
[0026] 氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母 代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
[0027] 5、碱性蛋白酶突变体的标识
[0028] 采用"原始氨基酸位置替换的氨基酸"来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。 如Serl03Glu，表示位置103的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Ser替换成Glu，位置的编号对 应于附件序列表SEQ ID N0:1中的编号。如Serl03Glu/Argl64Glu，表示位置103和位置 164的氨基酸都发生了突变。
[0029] 实施例1野生型碱性蛋白酶aprE重组菌株的构建
[0030] TIAN GEN 公司的 TIANr印 Rapid Mini Plasmid Kit 制备载体 pUBl 10,其制备过 程参照试剂盒的操作手册。
[0031] 实验中所用引物如下：
[0032] 弓1 _tgcagaagcggcaacacgctaaattaagcatgcaagctagttgc_3' ；
[0033] 弓丨物 2 :5' -ttttccccaacggtttcttcatcgttcatgtctccttttttatg-3'
[0034] 弓丨@ 3 _cataaaaaaggagacatgaacgatgaagaaaccgttggggaaaa_3'
[0035] 弓丨物 4 :5' -gcaactagcttgcatgcttaatttagcgtgttgccgctcctgca-3'
[0036] 以pUBllO质粒为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，获得载体基因序列。 扩增条件为：98°C IOmin ;98°C 10s，55°C 20s，72°C 3min，30 个循环；72°C lOmin。利用 Ε· Ζ· N. A. Gel Extraction Kit 回收 PCR 扩增产物。
[0037] 以克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii)基因组为模板，利用引物3和引物4进 行PCR扩增，获得克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因 aprE及信号肽序列。所述碱性蛋白 酶基因 aprE基因序列为SEQ ID N0:2,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。扩增条件 为：94Γ IOmin ;94°C 60s，58Γ 60s，72°C 2min，30 个循环；72Γ lOmin。利用 E. Z. N. A. Gel Extraction Kit回收PCR扩增产物。
[0038] 将目标片段（aprE)和载体片段通过重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如 下：5XPhusion HF Buffer 10yL，2.5mM dNTPs 8yL，Insert 86116(&卩也片段）4 4 1^， Linearized vector(pQC67)6yL，Phusion DNA Polymerase I yL，ddH20 21 yL。扩增条件 为98。(：1〇111丨11;98。(：1〇8,721€3111丨11，20个循环 ；98。(：1〇8,721€6111丨11，15个循环；72。(：1〇11^11。 将多聚体转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋 白酶aprE的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌BS(Bacillus subtilis BS)。提取枯草芽孢杆 菌BS里的质粒，将其命名为pQC67 (含有野生型aprE基因），其质粒图谱如附图1所示。
[0039] 上述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 1A751是利用感受态方法进行转化，具体 转化过程如下：将新鲜活化的B. subtilis 1A751由LB(胰蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，NaCl 1 % )平板接种到5ml GM I (GM I配制方法为：1*最低盐溶液95. 6ml，20 %葡萄糖2. 5ml， 5 %水解酪蛋白0. 4ml，10 %酵母粉汁Iml ;其中1*最低盐溶液的配制方法为=K2HPO4 Hg/ L，KH2PO4 6g/L，（NH4)2SO4 2g/L，柠檬酸三钠 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 2g/L，在蒸馏水中依次溶 解溶液，在30°C、125rpm振荡培养过夜。第二天取2ml转接到18ml GM I中，37°C、250rpm 培养3. 5h。再取IOml上一步骤的培养液转接到90ml GM II (GM II配制方法为：1*最低 盐溶液96. 98ml，20 %葡萄糖2. 5ml，5 %水解酪蛋白0. 08ml，10 %酵母粉汁0. 04ml，IM MgCl2 0.25ml，lM CaCl2 0.05ml 中，37°C、125rpm 培养 90min 后，5000g、10min 离心收集菌体