] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵 母细胞（Pichia pastoris) GSl 15,得到重组菌株 GSl 15/TLXynlOA。
[0034] 本发明还提供了上述酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA的应用。
[0035] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、酿酒、果汁、面包、造纸工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适PH 为4. 5,在pH3. 0~5. 5都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力；並 且具有良好的热稳定性。该木聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度 增加而引起的抗营养作用。在食品工业中，可用于降低啤酒酿造的麦芽汁粘度，降解果汁中 残留的半纤维素使之澄清，或者释放戊聚糖包裹的水分使发面更加蓬松。在造纸工业中，可 以在高温环境中替代有机氯化物进行纸浆漂白。由于其能降解木聚糖，因此，本木聚糖酶在 能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。
【附图说明】
[0036] 图1重组木聚糖酶的最适pH。
[0037] 图2重组木聚糖酶的pH稳定性。
[0038] 图3重组木聚糖酶的最适温度。
[0039] 图4重组木聚糖酶的热稳定性。
【具体实施方式】
[0040] 试验材料和试剂
[0041] 1、菌株及载体：本发明从（Talaromyces Ieycettanus)中分离得到一种新的酸性 嗜热木聚糖酶TLXynlOA。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GSl 15购自于Invitrogen公司。
[0042] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。 燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0043] 3、培养基：
[0044] (I) Talaromyces leycettanus JCM12802 培养基为马铃薯汁培养基：1000 mL 马铃 薯汁，IOg葡萄糖，25g琼脂，pH2. 5。
[0045] (2)大肠杆菌培养基LB(1 %蛋白胨、0. 5%酵母提取物、1 % NaCl，pH7. 0)。
[0046] (3)BMGY 培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1. 34% YNB，0. 00004% Biotin，1% 甘油（V/V)。
[0047] (4) BMMY培养基：除以0. 5 %甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4. 0。
[0048] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0049] 实施例1蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802木聚糖酶编码基因 TLXynlOA的克隆
[0050] 提取蓝状菌 12802Talaromyces leycettanus JCM12802 基因组 DNA :
[0051] 将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨 5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65°C水浴锅裂解20min，每隔IOmin混勾一次，在 4°C下1000 Orpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异 丙醇，于室温静置5min后，4°C下1000 Orpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤 两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20°C备用。
[0052] 根据第10家族木聚糖酶基因的保守序列STFNQY和WDVVNEA序列设计合成了简并 引物P1，P2
[0053] Pl:5' -TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3'；
[0054] P2:5'-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3' 。
[0055] 以 Talaromyces leycettanus JCM12802 总 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应参 数为：94°C变性5min ;然后94°C变性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环后 72°C保温lOmin。得到一约500bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物 技术有限公司测序。
[0056] 根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计 方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每 两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22~30nt，退火温度在60~65°C。通过 TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德生物技术有限公司 测序。拼接后木聚糖酶基因 TLXynlOA全长1095bp，编码364个氨基酸和一个终止密码子， N端17个氨基酸为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为38. 7kDa。
[0057] 实施例2重组木聚糖酶的制备
[0058] 将表达载体pPIC9进行双酶切（EcoR I+Not I)，同时将编码木聚糖酶的基因 TLXynlOA双酶切（EcoR I+Not I)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9 连接，获得含有Talaromyces leycettanus JCM12802木聚糖酶基因 TLXynlOA的重组质粒 PPIC-TLXynlOA并转化毕赤酵母GSl 15,获得重组毕赤酵母菌株GSl 15/TLXynlOA。
[0059] 以同样方法构建含有信号肽序列的木聚糖酶基因 TLXynlOA的重组表达质粒，并 获得重组重组毕赤酵母菌株。
[0060] 取含有重组质粒的63115菌株，接种于30011^81?^培养液中，301€ 250印111振荡培 养48h后，离心收集菌体。然后于150mLBMMY培养基重悬，30°C 250rpm振荡培养。诱导72h 后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为1326U/mL。SDS-PAGE 结果表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为1416U/mg。
[0061] 实施例4重组木聚糖酶的活性分析
[0062] DNS法：具体方法如下：在pH4. 5,60°C条件下，ImL的反应体系包括100 μ L适当的 稀释酶液，900以1^1%榉木木聚糖，反应1011^11，加入1.51^0吧终止反应，沸水煮51^11。冷 却后540nm测定OD值。1个酶活单位（U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1 μ mol还 原糖所需要的酶量。
[0063] 实施例5重组木聚糖酶TLXynlOA的性质测定
[0064] 1、重组木聚糖酶TLXynlOA的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
[0065] 将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。 底物木聚糖用不同pH的0. lmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中80°C下进行榉木木聚糖酶 活力测定。结果（图1)表明，重组酶TLXynlOA的最适pH为4.5,在ρΗ3· 5~5.0有60% 以上的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37°C处理60min，再在ρΗ4. 5 缓冲液体系中80°C下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果（图2)表明木聚糖酶在pH 2. 0-9. 0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60%左右，这说明此酶 在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
[0066] 2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
[0067] 木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4. 5)缓冲液体系 及不同温度下进行酶促反应。热稳定性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在 80°C下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图3)表明其最适温度为80°C。酶的 热稳定性性试验表明（图4)，TLXynlOA有良好的热稳定性，在60°C下温育lh，能保持90% 以上的酶活。
[0068] 3、木聚糖酶的KJ直测定方法如下：
[0069] 用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4. 5)缓冲液体系 中，80°C下测定酶活性，计算出其Kjl。经测定，以榉木木聚糖为底物时的Km值为2. 4mg/ mL，最大反应速度Vniax为1829U/mg。
[0070] 4、不同金属离子化学试剂对TLXynlOA酶活的影响测定如下：
[0071] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在80、pH4. 5条件下测定酶活性。结果表明，大部分 部分离子和化学试剂在浓度为5_〇1时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。仅Ag+可以抑 制其将近15 %的活力。
[0072] 5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：
[0073] 用pH2. OGly-HCl缓冲液配制0· lmg/mL胃蛋白酶，pH7. OTris-HCl缓冲液配制 0· lmg/mL胰蛋白酶。取pH2. OKCl-HCl缓冲液稀释后的0· 5mL纯化的酶液加入0· 5mL胃蛋 白酶，pH7. OTris-HCl缓冲液稀释后的0. 5mL纯化的酶液加入0. 5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶 /木聚糖酶（w/w)~0. 1，37°C保温30min和60min取样，在pH4. 5及80°C条件下测定酶活 性。实验结果表明木聚糖酶TLXynlOA用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，蛋白酶处理后 的TLXynlOA仍具有85%以上的酶活。
[0074] 6、重组木聚糖酶的底物特异性
[0075] 该酶可作用于各种木聚糖，如燕麦木聚糖，榉木木聚糖，桦木木聚糖以及小麦阿拉 伯木聚糖，主要切割β_1，4糖苷键，可将木聚糖分解为木糖或木二糖。几乎不降解纤维素。
[0076] 7、高温处理下的木聚糖酶
[0077] 该酶具有较强的热稳定性，用ρΗ4. 50. 2mM柠檬酸磷酸氢二钠进行稀释，调整浓度 为50 μ g/mL，进行沸水浴处理，IOmin后仍能保持80%以上活性。
【主权项】
1. 一种酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1或SEQ IDNO. 2 所示。2. 如权利要求1所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA，其特征在于，序列SEQIDNO. 1 在N端包含信号肽，所述信号肽的序列如SEQIDNO. 3所示。3. -种酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性嗜热木 聚糖酶TLXynlOA。4. 如权利要求3所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO. 4 或SEQIDNO. 5 所示。5. 如权利要求3所述的酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA，其特征在于，所述酸性嗜热木聚 糖酶TLXynlOA包括信号肽序列，所述序列如SEQIDNO. 6所示。6. 包含权利要求3所述酸性嗜热木聚糖酶基因TLXynlOA的重组载体。7. 包含权利要求3所述酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA的重组载体pPIC-TLXynlOA。8. 包含权利要求3所述酸性嗜热木聚糖酶基因TLXynlOA的重组菌株。9. 一种制备酸性嗜热木聚糖酶基因TLXynlOA的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达； 3) 回收并纯化所表达的酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA。10. 权利要求1所述酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.5，最适温度80℃，比活为1416U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解榉木木聚糖，燕麦木聚糖和桦木木聚糖以及易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料。
【IPC分类】C12N15/81, C12N1/19, C12N9/42, C12R1/84, C12N15/56
【公开号】CN105176950
【申请号】
【发明人】姚斌, 罗会颖, 王晓宇, 石鹏君, 王亚茹, 黄火清, 柏映国, 苏小运, 王苑, 孟昆
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月27日