一种酸性嗜热木聚糖酶TLXyn10A及其基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA 及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞 干重的40~45%，是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的线状结构分子。木质素约占 细胞干重的15~25%，是一种复杂酚类聚合物。半纤维素约占细胞干重的30~35%，是 继纤维素之后最丰富的可再生生物资源。半纤维素包括木聚糖，甘露聚糖，半乳聚糖等等， 完全降解半纤维素举要多种酶的协同作用，其中木聚糖酶是一种切割β -1，4-糖苷键的主 要酶类（ColIins et al. FEMS Microbiology Reviews. 2005, 29:3-23·)。在食品，饲料和纸 浆工业等方面有广阔的应用前景。
[0003] 在啤酒酿造过程中，麦芽中的木聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加 了啤酒的生产成本和品质，采用酸性木聚糖酶和木聚糖酶协同作用，可以解决以上 问题。在饲料制粒时，热稳定性优良的木聚糖酶可以较少的损失酶活，并在进食过 程中辅助消化提高营养（Flint and Bayer.Annals of the New York Academy of Sciences. 2008, 1125:280 - 288.)。而在纸浆漂白时，木聚糖酶可以替代部分有机氯化物， 从而减少环境污染（Gangwar, et al. Bioresources. 2014, 9 (2) : 3733-3754.) 〇
[0004] 由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶 的研究仍具有重大意义。本次克隆和分离的酸性嗜热木聚糖酶热稳定性非常好，可以适应 工业生产中的高温环境，可以更好的应用于饲料、酿酒和造纸工业。本发明中的木聚糖酶在 pH3. 5-5. 5下均具有较高酶活力，具有优良的pH稳定性，在pH2~9之间保持稳定，并且具 有胃蛋白酶以及胰蛋白酶抗性，表现出较高的木聚糖酶活性，其热稳定性优良显示出，在饲 料，啤酒，造纸等工业中，具有一定的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种酸性嗜热木聚糖酶。
[0006] 本发明的另一目的是提供编码上述酸性嗜热木聚糖酶的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备上述酸性嗜热木聚糖酶的基因工程方法。
[0010] 本发明的另一目的提供上述酸性木聚糖酶的应用。
[0011] 本发明从蓝状菌（Talaromyces Ieycettanus)中分离得到一种新的酸性嗜热木聚 糖酶TLXynlOA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] SEQ ID NO. 1 ：
[0013] MRFSLATAALLAGPALAAPPAPRHDDKDVGLNALAQRAGKLffFGTAADIPGTDETTDAAYLKILENPAN FGEITPANAMKFMYTEPEQNVFNYTG⑶YVLNLAERHGQRVRCHNLVWASQLSDFVNNGNWTKESLTAVMRNHIFHV VQHFGRRCYSWDVVNEALNGDGTFSSSIWYDTIGEDYFYLAFQYAQEALAEIHANDVKLYYNDYGIENPGTKADAVH NLVKELRKRDIRIDGIGLESHFEVGFTPSLQDQLSTKQGYIALGLDVAITELDVRFTQAPYYDAAGEKQQAQDYYTS VSSCIEAGPKCIGITVWDFDDKYSWVPYTFAGQGGADIYNATLQAKPAYYAIADALQGKACSVC
[0014] 其中，该酶基因编码364个氨基酸，N端17个氨基酸为其信号肽序列 "MRFSLATAALLAGPALA"（SEQ ID NO. 3)。
[0015] 因此，成熟的酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA的理论分子量为38. 7kDa，其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示：
[0016] APPAPRHDDKDVGLNALAQRAGKLffFGTAADIPGTDETTDAAYLKILENPANFGEITPANAMKFMYTEP EQNVFNYTGGDYVLNLAERHGQRVRCHNLVWASQLSDFVNNGNWTKESLTAVMRNHIFHVVQHFGRRCYSWDVVNEA LNGDGTFSSSIWYDTIGEDYFYLAFQYAQEALAEIHANDVKLYYNDYGIENPGTKADAVHNLVKELRKRDIRIDGIG LESHFEVGFTPSLQDQLSTKQGYIALGLDVAITELDVRFTQAPYYDAAGEKQQAQDYYTSVSSCIEAGPKCIGITVW DFDDKYSWVPYTFAGQGGADIYNATLQAKPAYYAIADALQGKACSVC
[0017] 本发明的木聚糖酶TLXynlOA同时具有好的pH稳定性，并且具有较强的抗胃蛋白 酶和胰蛋白酶降解特性。本发明筛选到Talaromyces Ieycettanus产生的木聚糖酶，其最适 pH值为4. 5,在pH2. 0~10. 0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为70°C -80°C ; 用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理30分钟，酶活无损失。
[0018] 本发明提供了编码上述酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA。具体地，该基因的基因组序 列如SEQ ID NO. 4所示：
[0019] ATGCGTTTCTCCTTGGCCACTGCAGCTCTTCTCGCTGGCCCTGCCCTGGCAGCGCCACCAGCTCCTCGT CACGATGACAAGGATGTTGGGCTCAACGCCCTGGCCCAGAGAGCAGGCAAGCTCTGGTTCGGCACTGCTGCTGATAT CCCCGGCACCGACGAGACGACCGATGCTGCGTACCTAAAAATCTTGGAAAATCCCGCCAACTTCGGCGAGATCACCC CTGCCAACGCCATGAAGTTCATGTACACCGAGCCAGAGCAGAACGTGTTCAACTACACCGGCGGTGACTACGTCCTG AACCTCGCCGAGCGCCACGGCCAGCGTGTCCGCTGCCACAACCTCGTCTGGGCCAGCCAGCTGTCCGACTTCGTCAA CAACGGCAACTGGACCAAGGAGTCCCTCACGGCCGTGATGCGGAACCACATCTTCCACGTCGTCCAGCACTTCGGCC GGCGCTGCTACTCGTGGGATGTCGTCAACGAGGCCCTCAACGGCGACGGCACCTTCTCCTCCAGCATCTGGTACGAC ACCATCGGCGAGGACTACTTCTACCTCGCCTTCCAGTACGCCCAGGAGGCCCTCGCGGAGATCCACGCCAACGACGT CAAGCTCTACTACAACGACTACGGCATCGAGAACCCCGGCACCAAGGCCGATGCCGTGCACAACCTCGTCAAGGAGC TGCGCAAGCGCGACATCCGCATCGACGGCATCGGTCTCGAGTCCCACTTCGAGGTCGGTTTCACCCCCTCCCTACAG GACCAGCTCAGCACCAAGCAGGGCTACATCGCGCTCGGTCTCGACGTCGCCATCACCGAGCTGGACGTGCGCTTCAC CCAGGCCCCTTACTACGATGCCGCGGGCGAGAAGCAGCAGGCCCAGGACTACTATACCAGCGTTTCTAGCTGCATCG AGGCCGGCCCCAAGTGCATCGGTATCACCGTCTGGGACTTCGATGACAAGTACTCGTGGGTTCCTTACACTTTCGCC GGCCAGGGTGGTGCAGATATCTACAATGCTACCTTGCAGGCCAAGCCTGCCTACTATGCCATTGCCGATGCTCTTCA GGGCAAGGCCTGCAGCGTCTGCTAG
[0020] 本发明通过PCR的方法分离克隆了酸性嗜热木聚糖酶基因 TLXynlOA，DNA全序列 分析结果表明，木聚糖酶TLXynlOA基因 TLXynlOA全长1095bp，编码基因序列全长1044bp。 其中，信号肽的碱基序列为：
[0021] ATGCGTTTCTCCTTGGCCACTGCAGCTCTTCTCGCTGGCCCTGCCCTGGCA
[0022] (SEQ ID NO. 6) 〇
[0023] 成熟的酸性嗜热木聚糖酶基因 TLXynlOA的cDNA (去信号肽）序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0024] SEQ ID NO. 5
[0025] GCGCCACCAGCTCCTCGTCACGATGACAAGGATGTTGGGCTCAACGCCCTGGCCCAGAGAGCAGGCAAG CTCTGGTTCGGCACTGCTGCTGATATCCCCGGCACCGACGAGACGACCGATGCTGCGTACCTAAAAATCTTGGAAAA TCCCGCCAACTTCGGCGAGATCACCCCTGCCAACGCCATGAAGTTCATGTACACCGAGCCAGAGCAGAACGTGTTCA ACTACACCGGCGGTGACTACGTCCTGAACCTCGCCGAGCGCCACGGCCAGCGTGTCCGCTGCCACAACCTCGTCTGG GCCAGCCAGCTGTCCGACTTCGTCAACAACGGCAACTGGACCAAGGAGTCCCTCACGGCCGTGATGCGGAACCACAT CTTCCACGTCGTCCAGCACTTCGGCCGGCGCTGCTACTCGTGGGATGTCGTCAACGAGGCCCTCAACGGCGACGGCA CCTTCTCCTCCAGCATCTGGTACGACACCATCGGCGAGGACTACTTCTACCTCGCCTTCCAGTACGCCCAGGAGGCC CTCGCGGAGATCCACGCCAACGACGTCAAGCTCTACTACAACGACTACGGCATCGAGAACCCCGGCACCAAGGCCGA TGCCGTGCACAACCTCGTCAAGGAGCTGCGCAAGCGCGACATCCGCATCGACGGCATCGGTCTCGAGTCCCACTTCG AGGTCGGTTTCACCCCCTCCCTACAGGACCAGCTCAGCACCAAGCAGGGCTACATCGCGCTCGGTCTCGACGTCGCC ATCACCGAGCTGGACGTGCGCTTCACCCAGGCCCCTTACTACGATGCCGCGGGCGAGAAGCAGCAGGCCCAGGACTA CTATACCAGCGTTTCTAGCTGCATCGAGGCCGGCCCCAAGTGCATCGGTATCACCGTCTGGGACTTCGATGACAAGT ACTCGTGGGTTCCTTACACTTTCGCCGGCCAGGGTGGTGCAGATATCTACAATGCTACCTTGCAGGCCAAGCCTGCC TACTATGCCATTGCCGATGCTCTTCAGGGCAAGGCCTGCAGCGTCTGCTAG
[0026] 成熟蛋白理论分子量为38. 7kDa，TLXynlOA是一种新的木聚糖酶。
[0027] 本发明还提供了包含上述酸性嗜热木聚糖酶基因 TLXynlOA的重组载体，优选 为pPIC-TLXynlOA。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方 案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoRI和Not I限制性酶切 位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPIC9-TLXynlOA〇
[0028] 本发明还提供了包含上述酸性嗜热木聚糖酶基因 TLXynlOA的重组菌株，优选所 述菌株为酵母菌，优选为重组菌株GS115/TLXynlOA。
[0029] 本发明还提供了一种制备酸性嗜热木聚糖酶TLXynlOA的方法，包括以下步骤：
[0030] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0031] 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及
[0032] 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶TLXynlOA。
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