细胞集落。
[0034]在建立永生化的奶牛乳腺上皮细胞系时，具体包括如下步骤:
[0035](I)将奶牛乳腺组织放入含约4?5倍青霉素和链霉素的DMEM培养基中。
[0036](2)将乳腺组织剪碎，反复清洗，直至上清液清亮，均匀接种在培养瓶中，放入5%C02、37°C培养箱中培养10天。通过细胞刮除、相差消化、相差贴壁法来纯化奶牛乳腺上皮细胞，在细胞增殖过程中一些细胞开始衰老。
[0037](3)采用上述实施例1中描述的病毒法，使用HPV16型E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞，使该细胞永生化。
[0038](4)待步骤3)中永生化过后的细胞密度汇合至80%，用Iml的胰酶分离消化奶牛乳腺上皮细胞群落，2ml培养基终止消化，吹打悬浮细胞，细胞计数。通过连续稀释使细胞的最终浓度为5?10个/ml。吸取200 μ I细胞悬液接种到96孔板中，使每孔只有I个细胞，总共接种5个96孔板。培养一周后，每个96孔板都会出现克隆。换液，继续培养一周。待孔内细胞密度汇合至50%时，胰酶消化分离奶牛乳腺上皮细胞，转移到25cm2培养瓶中扩大培养并进一步传代培养。
[0039]对培养的永生化奶牛乳腺上皮细胞的生长规律研究和细胞形态学鉴定:
[0040]在进行细胞生长规律的研究中，以IX 14个永生化细胞/cm2来接种奶牛乳腺上皮细胞，3天之后奶牛乳腺上皮细胞的密度为60?80%。适合在6孔板和25cm2、75cm2等培养瓶中培养，培养3天之后，细胞密度仍然是70 %，此结果说明了细胞在生长过程中，符合一般的细胞生长曲线规律。
[0041]在进行细胞形态学特征观察时，经过本发明病毒感染方法永生化的奶牛乳腺上皮细胞形态呈现岛屿状集落生长，有些呈现铺路石生长。永生化的奶牛乳腺上皮细胞形态(图1a)与前10代的未永生化的奶牛乳腺上皮细胞形态类似，然而其与15代之后的未永生化的奶牛乳腺上皮细胞形态有些差异。15代之后的未永生化的细胞开始衰老，由此而增大的细胞质(细胞体积)可以在图1b中明显辨认出来。
[0042]奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18的鉴定:
[0043](I)按 IX 14个/cm2细胞密度接种在 4 孔 Chamber Slide ；
[0044](2)待细胞密度为60?80%，PBS洗3次。用4% PFA固定约30min，然后PBS洗3次；
[0045](3) 3%血清室温封闭20?30min，然后移除血清；
[0046](4)加细胞角蛋白18 一抗(1:200稀释)，4°C孵育过夜，PBS洗3次；
[0047](5)加荧光素二抗室温避光孵育lh，PBS洗3次；
[0048](6)核进行DAPI染色，室温7min ；
[0049](7) PBS洗3次，然后蒸馏水洗I次；
[0050](8)封固剂封片，避光24?48h ；
[0051](9)荧光显微镜观察细胞角蛋白18在奶牛乳腺上皮细胞膜中的表达(图2):图中细胞形态呈现铺路石和鳞状等，此结果说明了单克隆细胞是上皮型。
[0052]奶牛乳腺上皮细胞核型分析:
[0053](I)加秋水仙素:取对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞，加秋水仙素到培养液内，终浓度为0.05?0.1 μ g/ml ο 37 °C培养箱中继续培养4?5h ;
[0054](2)酶消化分离细胞，转入15ml离心管，室温1000rpm/min，离心lOmin，收集细胞；
[0055](3)吸去上清液，加入37°C预热、0.075mol/L KCl溶液7ml，轻轻吹打均匀，38.5°C水浴锅中温育18min ;
[0056](4)悬液中加入新鲜固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，打匀(轻轻吹打防止细胞破裂)；立即室温1000rpm/min，离心lOmin，弃上清；
[0057](5)加入新鲜固定液，轻轻吹打混勾，固定30min ；
[0058](6)室温 1000rpm/min，离心 lOmin，弃上清；
[0059](7)重复(5)和(6)；
[0060](8)视离心管中细胞量加入固定液，吹打均匀；
[0061](9)立即取出擦镜纸擦干净后于冰上预冷的载玻片。在载玻片上方约Im高处用吸管迅速滴上I?3滴细胞悬液，用嘴轻轻吹散，室温凉干；
[0062](1)Giemsa工作液染色20min，自来水冲洗室温晾干。用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗)，凉干后镜检
[0063](11)先用低倍镜寻找良好的分裂相，再使用高倍油镜观察拍照(图3):
[0064]在图3中，可以观察到奶牛乳腺上皮细胞仍然保持着二倍体核型，此结果说明了采用本发明方法永生化后的奶牛乳腺上皮细胞依然具有生物学功能和遗传稳定性。
[0065]Western blot检测HPV16E6E7病毒蛋白在奶牛乳腺上皮细胞中的表达:
[0066](I)细胞总蛋白样品制备:待阳性奶牛乳腺上皮细胞大量生长，提取奶牛乳腺上皮细胞提取细胞总蛋白。同时，提取原代奶牛乳腺上皮细胞总蛋白(阴性对照)和Caski细胞的总蛋白(阳性对照)，进行Western blot验证E6和E7病毒基因是否在奶牛乳腺上皮细胞中表达。吸弃培养基用PBS清洗3次，胰酶消化分离奶牛乳腺上皮细胞，4°C 100rpm离心5min，使细胞沉淀，弃上清。根据细胞数量加入RIPA裂解液(RIPA:蛋白酶抑制剂=50:1), 一般加入200 μ I的RIPA裂解液，放冰上裂解30min，每隔1min在漩涡振荡器上漩涡30s，4°C 12000g离心lOmin。小心吸取上清，即细胞总蛋白。测定各个样品的蛋白浓度，加入RIPA裂解液和蛋白上样缓冲液使各组间的蛋白浓度一致。沸水浴变性lOmin，使蛋白充分变性。
[0067]⑵SDS-PAGE电泳:安装好B1_rad制胶架。根据目的蛋白的分子量大小，配置所需分离胶浓度。按各组分的比例配置12%的分离胶，上下颠倒混匀10次，使之充分反应。将液体胶加入玻璃板之间，并用酒精封闭，室温下分离胶聚合40min。再配置5%浓缩胶，将分离胶上方的残留酒精用滤纸吸尽，加5%浓缩胶插梳子，禁止泳道间气泡产生，室温下聚合40min。将胶放入电泳槽中，小心拔出梳子。将样品和标准品分别加到样品孔内。100V恒压跑电泳，直到溴酚蓝跑到前沿为止。
[0068](3)转膜:将NC膜和滤纸裁成和胶大小一样略大的小块。NC膜和滤纸放入预冷转膜缓冲液中浸泡20min。转膜顺序为阴极碳板，海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵，阳极碳板。100V，80min在冰浴中进行转膜。
[0069](4)封闭和杂交:根据目的蛋白和β -actin分子量大小，用剪刀剪下所需NC膜条带，放入5%脱脂奶粉的封闭液封闭90min。加入β -actin、E6和E7 —抗(1:250稀释)，4°C慢摇孵育过夜。TBST清洗液清洗6次，每次lOmin。加入二抗(1:3000稀释)室温慢摇孵育90min。TBST清洗液清洗6次，每次lOmin。
[0070](5)特异性条带的检测:一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法来检测目的蛋白。将A液和B液按1:1混合，用滤纸吸干膜上的液体，加发光液，置于凝胶成像系统曝光(图4):此结果说明了 HPV16E6和E7基因被整合至基因组上并稳定表达E6E7蛋白，这对奶牛乳腺上皮细胞的永生化具有重要作用。
[0071]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)接种奶牛乳腺上皮细胞； 2)待细胞生长至密度大约为50%-70%时，弃上清液，用PBS清洗细胞； 3)将泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液加入步骤2)中的奶牛乳腺上皮细胞中； 4)将步骤3)中获得的混合液离心，留取上清液； 5)将步骤4)中获得的上清液放置37°C、5%CO2培养箱中孵育24h ; 6)吸弃步骤5)中获得混合液的上清液，加DMEM/F12培养基继续培养； 7)待细胞密度汇合至70%-80%时，用抗生素筛选阳性克隆。2.如权利要求1所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，在步骤3)中的泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液中加入聚凝胺。3.如权利要求2所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，所述聚凝胺的浓度为6 μ g/mlo4.如权利要求1或3所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，在步骤4)中获得的上清液中加入刺激因子。5.如权利要求4所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，所述刺激因子为表皮生长因子、氢化可的松、催乳素和胰岛素-转铁蛋白-砸。6.如权利要求5所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，所述刺激因子的加入量分别为:终浓度为20ng/ml表皮生子因子、I μ g/mL氢化可的松、和4ug/ml催乳素和I倍胰岛素-转铁蛋白-砸。7.一种建立永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤: a)将采集到的奶牛乳腺组织在培养基中剪碎后，将其上清液接种在培养瓶中进行组织块原代培养； b)采用权利要求1所述的方法永生化法奶牛乳腺上皮细胞； c)筛选阳性克隆，进行细胞系的培养。
【专利摘要】本发明提供了一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，在采用HPV？E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞使其永生化时，添加泛嗜性和兼嗜性病毒颗粒，从而增加病毒感染效率。本发明还提供了一种建立永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法，包括以下步骤：1)对奶牛乳腺组织在培养瓶中进行组织块原代培养；2)采用上述的病毒法感染原代奶牛乳腺上皮细胞，以使其永生化；3)筛选阳性克隆，进行细胞系的培养。使用这些方法可以高效率地对奶牛乳腺上皮细胞进行永生化，并且建立生长速度快和稳定连续传代的奶牛乳腺上皮细胞系，从而获得具有生理功能的奶牛乳腺上皮细胞，为奶牛乳腺上皮细胞的泌乳营养调控和奶牛乳房炎的发病机制研究提供实验细胞素材。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105176913
【申请号】
【发明人】赵国琦, 詹康, 霍永久, 林淼, 刘明美, 郭静
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月23日