一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域,涉及细胞原代培养、单克隆细胞获得、western blot检测E6、E7病毒在奶牛乳腺上皮细胞的表达和建立奶牛乳腺上皮细胞系的方法。
【背景技术】
[0002]奶牛乳腺上皮细胞(BMEC, Bovine mammary epithelial cell)具有合成和分泌乳蛋白的功能,对微生物入侵乳腺组织具有防御作用。同时,它是乳腺组织重要的反应细胞。因此,进行奶牛乳腺上皮细胞的原代培养和细胞永生化被视为奶牛泌乳营养调控和奶牛乳房炎发病机制研究重要细胞模型。
[0003]国内外基本上采用酶消化法分离培养原代培养奶牛乳腺上皮细胞(Wang M Z, Xu BL, Wang H R, et al./‘Effects of arginine concentrat1n on the in vitro express1nof casein and mTOR pathway related genes in mammary epithelial cells from dairycattle”,PLos One, 2014(5):e95985),此方法能够快速获得原代奶牛乳腺上皮细胞且成纤维细胞较少。然而,获得的奶牛乳腺上皮细胞由于经过高浓度酶长时间消化,细胞膜的受体蛋白受到严重的破坏,导致一系列的信号转导通路受阻,无法很好地实现奶牛乳腺上皮细胞的生理功能。
[0004]在国内进行的奶牛乳腺上皮细胞的培养相关试验(陈建晖,佟慧丽,李庆章等,“奶牛乳腺上皮细胞系的建立”2009,40 (5):743-747)中,这些细胞只能进行有限的传代培养,并不能很好的保存奶牛乳腺上皮细胞系。与之相比,国外的奶牛乳腺上皮细胞系传代次数较多。然而,在利用奶牛乳腺上皮细胞系进行传代过程中,随着细胞传代数的增加,奶牛乳腺上皮细胞系将会失去乳腺组织生理功能,如:染色体的核型改变,呈现单倍体或多倍体。染色体数目改变都将造成试验数据的误差,甚至使得有些奶牛乳腺上皮细胞系根本不能表达乳蛋白,这样就失去了利用奶牛乳腺上皮细胞来研究泌乳营养调控及其泌乳机制的意义。因此,建立功能性的永生化奶牛乳腺上皮细胞系迫在眉睫。
[0005]病毒法是使得细胞永生化的方法之一,能够有效地将靶基因整合到宿主细胞的基因组中。与传统的转染和电穿孔转基因方法相比,此方法对细胞没有毒害、感染效率高且能稳定表达。目前使细胞永生化的病毒基因较多,如,hTERT、SV40、HPV16E6E7等病毒基因。其中,HPV E6和E7病毒基因是来自于女性宫颈癌细胞表达的产物,能够使人上皮细胞永生化(Tsao S A, Wang X H, Liu Y, “Establishment of two immortalized nasopharyngealepithelial cell lines using SV401arge T and HPV16E6/E7viral oncogenes,,.B1chimica et B1physica Acta, 2002 (1590): 150-158)。HPV E6 和 E7 病毒基因分别使得人类上皮细胞永生化的两个重要信号通路pRb_pl6INK4a和p53失活,从而使细胞分别绕过Ml和M2期,最终使细胞具有无限增值的能力。然而,目前尚无HPV E6和E7能够使奶牛乳腺上皮细胞永生化的报道。因而,将上述人上皮细胞的永生化方法应用到奶牛乳腺上皮细胞具有以下几点难点和疑点:1)在利用病毒法将目的基因转导进入奶牛乳腺上皮细胞内时,病毒骨架上的包膜糖蛋白Vsvg是否能够结合奶牛乳腺上皮细胞脂质,虽然目前研究中,Vsvg蛋白能够结合大多数人或小鼠上皮细胞膜上的脂质,但是尚未见其能够结合奶牛乳腺上皮细胞膜上的脂质的报道;2)由于病毒的滴度低,加上原代奶牛乳腺上皮细胞“无法快速分离导致细胞繁殖慢”的特点,会造成感染细胞效率低。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术中的难点和疑点,本发明提供了一种高效率地利用HPV E6和E7病毒基因对奶牛乳腺上皮细胞进行永生化的方法,以及一种建立生长速度快和稳定连续传代的奶牛乳腺上皮细胞系的方法,从而获得具有生理功能的奶牛乳腺上皮细胞,为奶牛乳腺上皮细胞的泌乳营养调控和奶牛乳房炎的发病机制研究提供实验细胞素材。
[0007]为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:
[0008]本发明提供了一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法,其特征在于,在采用HPV E6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞使其永生化时,添加泛嗜性和兼嗜性的病毒颗粒。与增加单一嗜性的病毒颗粒相比,这样能够与奶牛乳腺上皮细胞表面结合更多的跨膜分子,从而增加病毒感染效率。
[0009]其中,采用以下病毒法永生化原代奶牛乳腺上皮细胞,包括以下步骤:
[0010]I)接种奶牛乳腺上皮细胞;
[0011]2)待细胞生长至密度大约为50% -70%时,弃上清液,用PBS清洗细胞;
[0012]3)将泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液加入步骤2)中的奶牛乳腺上皮细胞中;
[0013]4)将步骤3)中获得的混合液离心,留取上清液;
[0014]5)将步骤4)中获得的上清液放置37°C、5% CO2培养箱中孵育24h ;
[0015]6)吸弃步骤5)中获得混合液的上清液,加DMEM/F12培养基继续培养;
[0016]7)待细胞密度汇合至70% -80%时,用抗生素筛选阳性克隆。
[0017]可选地,可以在步骤3)中的泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液中添加聚凝胺以消除混合后病毒和细胞之间产生电荷排斥,使得病毒能够更好地接触细胞膜表面,增加感染效率。
[0018]可选地,可以在步骤4)中获得的上清液中加入表皮生长因子、胰岛素-转铁蛋白-砸元、催乳素和氢化可的松等刺激因子,促进原代奶牛乳腺上皮细胞能够快速进入细胞的分裂期。由于处于分裂期的细胞更容易被病毒感染,从而最终实现提高病毒转基因效率的目的。
[0019]本发明还提供了一种建立永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法,其特征在于,包括以下步骤:
[0020](I)将采集到的奶牛乳腺组织在培养基中剪碎后,将其上清液接种在培养瓶中进行组织块原代培养。与目前常用的酶消化法相比,这样培养的细胞有较强的细胞活力,增殖速度快,是一种获得类似于奶牛体内的原代乳腺细胞方法;
[0021](2)采用本发明上面叙述的病毒法感染原代奶牛乳腺上皮细胞,以使得奶牛乳腺上皮细胞永生化;
[0022](3)筛选阳性克隆,使细胞在形态、遗传、染色体稳定性和生物学功能上保持一致,进行细胞系的培养。
[0023]优选地,在步骤(2)中,当原代奶牛乳腺上皮细胞密度达到50%时就进行病毒感染。与人的乳腺上皮细胞达到70%才进行感染的情况相比,当细胞密度达到50%进行病毒感染,能够产生更多的阳性克隆,为下一步成功进行单克隆细胞创造条件。
[0024]本发明的技术方案实现了如下的有益效果:
[0025](I)在病毒感染奶牛乳腺上皮细胞过程中,由于原代细胞增值缓慢,并且不能够快速分裂,细胞处于静息期,这使得病毒很难感染细胞。在本发明提供的奶牛乳腺上皮细胞永生化方法中,使用泛嗜性和兼嗜性病毒颗粒同时感染奶牛乳腺上皮细胞。由于这两种病毒颗粒可以感染细胞膜表面不同的跨膜分子,进而增加泛嗜性以及兼嗜性病毒颗粒的包膜糖蛋白结合细胞膜表面的脂质受体以及GALV和RAMl受体,从而提高病毒感染效率。同时,在本发明的技术方案中,也可以在病毒的上清液内加入表皮生长因子、胰岛素-转铁蛋白-砸元、催乳素和氢化可的松,从而使原代奶牛乳腺上皮细胞能够快速进入细胞的分裂期。由于处于分裂期的细胞更容易被病毒感染,从而达到增加转基因效率的目的。
[0026](2)本发明提供的建立永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法采用组织块原代培养的方式,使得培养出来的细胞具有较强的细胞活力,增殖速度快。此外,由于在此培养的过程中无需添加细胞生长因子,大大地节省了成本。
[0027](6)采用本发明的方法建立的永生化奶牛乳腺上皮细胞系可以永久性保存,避免了多次采集乳腺组织带来的麻烦,可作为商品化的细胞系。
【附图说明】
[0028]图1是奶牛乳腺上皮细胞的细胞形态电子显微镜图(放大100倍)。其中,(a)是通过HPV16E6和E7永生化的奶牛乳腺上皮细胞;(b)是未转入HPV16E6和E7的第15代的奶牛乳腺上皮细胞。
[0029]图2是奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18免疫荧光显微镜照片(放大200倍)。
[0030]图3是奶牛乳腺上皮细胞染色体核型分析。
[0031]图4是检测HPV16E6和HPV16E7病毒蛋白在奶牛乳腺上皮细胞中的表达的Western blot结果。其中,BMEC:奶牛乳腺上皮细胞;Cask1:女性宫颈癌细胞;BMEC_E6E7:转染入HPV16E6和E7的奶牛乳腺上皮细胞;β -actin: β -肌动蛋白。
【具体实施方式】
[0032]为了阐明本发明的技术方案及技术目的,下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步的介绍。
[0033]采用病毒法感染原代奶牛乳腺上皮细胞,将HPV16E6和Ε7病毒基因导入奶牛乳腺上皮细胞中:1)接种I X 15个奶牛乳腺上皮细胞于6孔板中,2)待细胞生长至密度大约为50%时,弃上清液,用2ml的PBS清洗细胞3次;3)将Iml的泛嗜性病毒液和Iml兼嗜性病毒液加入含有奶牛乳腺上皮细胞6孔板中;4)加入6 μ g/ml聚凝胺,以消除病毒和细胞之间的电荷差异,使病毒能够更好地接触细胞膜表面,增加感染效率。虽然聚凝胺对某些细胞有毒,但是对奶牛乳腺上皮细胞毒性并不大,左右摆动6孔板,混合均匀;5)将六孔板放入离心机中,36°C离心90min ;6)在离心后的病毒上清液中加入终浓度为20ng/ml表皮生子因子、I μ g/mL氢化可的松、和4ug/ml催乳素(Sigma)和I倍胰岛素-转铁蛋白-砸(Invitrigen) ;7)将6孔板放置37°C、5% Co2培养箱中孵育24h ;8)感染过夜之后,将上清液吸弃,加DMEM/F12培养基继续培养;9)待细胞密度汇合至70%时,用300?500 μ g/ml的G 418抗生素筛选阳性克隆,连续筛选15天。根据培养基的颜色变化进行换液,一般每隔5天换液。I?3天奶牛乳腺上皮细胞在G 418抗生素作用下死亡不明显,第4天之后,在G 418抗生素作用奶牛乳腺上皮细胞开始慢慢死亡。第10天,未导入病毒基因的奶牛乳腺上皮细胞全部死亡。然而,培养瓶内还有一些奶牛乳腺上皮细胞开始增殖且速度较快,出现