pET14b、pETM-11表达载体及对应的 0rigima(DE3)、C41 (DE3)或 C41 (DE3)pLysS、BL21 (DE3)或 BL21 (DE3)pLysS 宿主细胞。最 终选择将FGF-18正确编码序列应用BamH I和Nde I酶切后插入到表达载体pET3a，并最终 构建了高效稳定表达的pET3a-rhFGF_18/0rigima(DE3)工程菌株。
[0011] 进一步，本发明提供了一种生产重组人成纤维细胞生长因子-18的方法，通过优 化培养基、控制参数及补料流加策略，建立了高密度培养方法，最后通过色谱分离技术得到 高纯度的rhFGF-18。具体包括如下步骤：
[0012] (1)降低罐内培养基中底物浓度，特别是降低底物中碳源含量，并通过流加碳源、 氮源、无机盐、微量元素及促生长因素等营养成分，延长对数生长期并保护质粒的稳定遗 传，促进工程菌生长及产物的合成。通过优化诱导前后关键控制参数，获得了高密度、高效 表达可溶性rhFGF-18的发酵生产工艺。
[0013] (2)根据rhFGF-18蛋白特性，筛选并添加适宜的蛋白稳定剂及缓冲体系，并通过 串联合理的纯化方法，获得了较高纯度及收率的纯化生产工艺。具体包括：通过二步超滤 方法进行初步纯化，即选择IOKD超滤膜分离去除小分子量杂质，再通过选择30KD~50KD 超滤膜分离去除大分子量杂质，达到初步浓缩的目的；通过二步柱层析技术进行精细纯化， 即选用阳离子交换柱层析（SP Sepharose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow)捕获量 大，易处理特性进行中度纯化，去除大部分杂质；选用肝素亲和柱层析（heparin Sepharose 6FF或HiTrap HeparinHP)通过肝素与目标蛋白特异性结合的特性进行高度纯化。
[0014] (3)建立用小鼠胚胎成纤维细胞株（NIH/3T3)及小鼠成骨细胞（MC/3T3-E1)结合 MTT比色法，检测重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白体外生物学活性方法。
[0015] 本发明具有以下优点：
[0016] (1)通过对FGF-18核苷酸序列进行优化及筛选适宜的表达载体和宿主细胞的组 合，获得高效稳定表达的工程菌株，表达水平达到菌体总蛋白的30%以上，并以可溶性形式 表达；
[0017] (2)通过建立高密度培养方法，rhFGF-18的表达水平达到菌体总蛋白的20%以 上，菌体产量达75g/L发酵液以上；
[0018] (3)通过超滤及二步柱层析方法，提高了蛋白纯度及收率。蛋白收率达彡120mg/L 发酵液，蛋白纯度彡95%。
[0019] (4)建立了用小鼠胚胎成纤维细胞株（NIH/3T3)结合MTT法，通过促进成纤维细胞 增殖测定其体外生物学活性测定方法及用小鼠成骨细胞（MC/3T3-E1)结合MTT比色法，通 过促进成骨细胞增殖测定其体外生物学活性测定方法。两种方法的实验结果均呈典型的S 型曲线，并在一定范围内具有剂量依赖性，显示出良好的重复性和可靠性。
【附图说明】
[0020] 图 I pET3a-FGF_18 重组载体图
[0021] 图2质粒双酶切鉴定图
[0022] 图3 rhFGF-18发酵表达SDS-PAGE电泳分析
[0023] 图4 rhFGF-18柱层析SDS-PAGE电泳分析
[0024] 图5 MTT法测定rhFGF-18蛋白对NIH/3T3细胞的促增殖生物学活性
[0025] 图6 MTT法测定rhFGF-18蛋白对MC/3T3-E1细胞的促增殖生物学活性
【具体实施方式】
[0026] 实施例1 rhFGF-18蛋白高效表达工程菌的构建
[0027] 根据GenBank中公布的人FGF-18天然序列（登录号：NM-003862. 2)和氨基酸序 列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变 氨基酸序列的条件下，设计rhFGF-18的编码序列引物。通过PCR扩增的方法获得rhFGF-18 的全长目的序列。人工合成重组人成纤维细胞生长因子-18 (rhFGF-18)基因的全序列时， 在该基因的5'端引入NdeI酶切位点及在3'端引入BamHI酶切位点。其中，人工合成重组 人成纤维细胞生长因子-18 (rhFGF-18)基因的全序列如SEQ ID NO. 1所示，rhFGF-18的编 码序列引物序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0028] 用NdeI和BamHI双酶切分别处理基因 rhFGF-18和表达载体如pET3a、pET3c、 pET14b、pETM-ll，37°C酶切3h回收相应的片段，用T4DNA连接酶在16°C连接过夜。连 接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素（100 μ g/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并 进行质粒酶切鉴定。抽提的质粒DNA用限制性内切酶及Ndel+BamHI在37°C反应3h，得 到在 pET 载体中插入了 rhFGF-18 基因的重组质粒 pET3a-rhFGF-18、pET-3c-rhFGF-18、 pET-14b-rhFGF-18、pETM-ll-rhFGF-18。利用菌落PCR进行阳性鉴定，应用 Ndel+BamHI 双酶 切时，能切出大小约543bp的片段，表明序列已正确插入载体中。用常规方法进行正、逆向 序列分析，委托Invitrogen公司进行序列的测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。将 重组质粒转化 〇rigima(DE3)、C41 (DE3)或 C41 (DE3)pLysS、BL21 (DE3)或 BL21 (DE3)pLysS 表达宿主菌种，用抗性筛选出高效表达单菌落，进行摇瓶培养，该诱导后测定目的蛋白表达 量，并进行免疫印迹（Western Blot)检测呈现阳性反应，证实所表达的重组外源蛋白为 rhFGF-18。实验结果表明，pET3a-rhFGF-18/0rigima(DE3)工程菌株表达的目的蛋白表达 量占总蛋白30%以上，优于其他表达载体和宿主菌的组合。
[0029] 实施例2 rhFGF-18蛋白高密度培养方法的建立
[0030] 挑取实施例1中制备的转入pET3a-rhFGF_18的大肠杆菌0rigima(DE3)单克隆菌 株，接种到LB液体培养基中，培养至A_达到0. 8~1. 2,按1:10的比例接种于含有磷酸盐 及葡萄糖的LB液体培养基中，扩大培养至A_达到3~5,按1:10接种罐内培养基中。通 过流加流加碳源（葡萄糖或甘油）、氨水调节PH6. 8~7. 0、培养温度，37°C，通过调节转数、 通气量等，维持DO2S 25% ;待A 6。。达到18~20,流加 IPTG至终浓度0. 5mmol/L开始诱导。 通过流加适当补加碳源（葡萄糖或甘油）、氨水调节pH7. 1~7. 2,并流加氮源、磷酸盐缓冲 液，诱导温度33°C，通过调节转数、通气量等，维持DO2^ 25%，诱导4h~5h带菌密度基本 稳定后确定为发酵终点。放罐、4°C、8000rpm离心10min，称重放-20°C冻存，取一定量样品 进行SDS-PAGE检测，测定目的蛋白的表达量。在已发表文章技术基础上，对高密度培养方 法进行改进和优化，使rhFGF-18蛋白表达量及菌体密度得到大幅提高。
[0031] 表1各阶段培养基组成
[0033] 表2高密度发酵培养结果与已发表数据对照表
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[0036] 实施例3 rhFGF-18蛋白纯化方法的建立
[0037] 1、菌体破碎
[0038] 在原有超声破碎基础上，对其破菌生产工艺进行优化与放大即采用高压均质破碎 方法。将菌体室温融化后，以I :20(g :mL)比例充分悬浮于细胞裂解缓冲液（50mM Tris，2mM EDTA-2Na, 0.1 M NaCl, 1% Triton X-100, 5mM DTT，蛋白酶抑制剂，pH7. 5)，进行高压均质。 破碎方式为200bar循环1次，再以800bar均质1~2次，镜检在可见视野范围内无完整大 肠杆菌后，20000rpm离心，4°C，30min，弃沉淀，收集上清。
[0039] 2、超滤
[0040] 取上述离心后的上清，栗入装有IOKD膜的超滤装置，弃去离出液，分离去除小分 子量杂质；再将剩余液体栗入装有30KD膜的超滤装置，收取离出液，分离去除大分子量杂 质，达到初步浓缩的目的，并减少了杂质的干扰。
[0041] 3、柱层析纯化
[0042]