一种重组人成纤维细胞生长因子（fgf）-18的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种优化的生产人成纤维细胞生长因 子-18(FGF-18)的方法，以及用于该方法的表达载体、宿主细胞、活性测定方法及可能的临 床应用。
【背景技术】
[0002] FGF18是FGF家族的一个新成员，是一种可分泌蛋白。1998年，日本科学家 Ohbayashi首次从老鼠胚胎中分离得到了 FGF-18。人FGF-18基因编码一个207氨基酸组 成的蛋白序列，分子质量约为23kDa ;基因定位于染色体5q34,共有5个外显子，与已发现 的？6?8其他成员有30%~70%的同源性。在结构上，？6?-18和？6-8、？6?-17相似，具有 70%~80%的氨基酸序列同源性，为同一亚家族成员，但它们的生物学功能却有很大的差 另lj。FGF-18在骨骼生长发育过程中扮演着重要的角色，也参与皮质神经元活动，腺垂体的 生存、分化和增殖及调节头发的生长和皮肤修复。体内外的多项研究表明，FGF18在形态发 生、血管形成、肿瘤生长和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用
[0003] 大量体内外的研究都表明，FGF-18在骨骼发育中的具有不可替代的作用，它是骨 骼发育过程中的一个重要的中介物。据报道，FGF-18在长骨发育过程中的软骨膜内和颅骨 发育过程中成骨间充质细胞中显著性表达。此外，FGF-18基因敲除的小鼠肋骨畸形导致胸 腔体积的减少，可能会引发呼吸衰竭，同时还发现了关节发育的缺陷。对FGF18鼠的胚胎研 究显示，FGF-18是一种骨骼的周期调节剂。并且，有研究进一步证实，在FGF-18基因缺陷 小鼠成骨过程中，颅骨骨缝闭合和长骨骨化延迟。据报道，FGF-18基因缺陷小鼠会出现延 迟骨化和减少骨性标记、骨桥蛋白及骨钙素的表达。Ohbayashi等研究发现，FGF-18基因敲 除小鼠胚胎显示，成骨间充质细胞增殖减少，而观察到软骨细胞增殖和分化增加。因此，在 胚胎发育过程中，FGF-18最有可能对成骨生成起正向促进作用和对软骨形成起负向抑制作 用。Kapadia等的研究进一步证实了，FGF18在胚胎发育期可抑制骨软骨细胞增殖和分化。 与此相反，在成年个体FGF-18对其他软骨组织（除了生长面）的软骨细胞具有正向作用。 据报道，在胚胎发育期的骨膜中，FGF-18可以通过增强预软骨细胞的分化来促进软骨修复。 同时，Ellsworth等研究显示腺病毒介导转移FGF18到小鼠外耳刺激细胞的增殖，导致软骨 细胞数量的增加、蛋白聚糖表达以及II型胶原蛋白的上升。最近的研究报告显示，在软骨 细胞增殖过程中，FGF-18合成作用增强可能是由特定组织的损伤或受损后通过另外的生长 因子和细胞因子的表达所致。在另一项研究中发现，FGF18能提高骨形态发生蛋白（BMP)的 功能及通过抑制头蛋白的表达来刺激软骨形成。
[0004] FGF-18存在于多种细胞类型中，其功能并不仅仅局限于骨骼发育，它是一个多效 性生长因子，可刺激众多间质细胞和上皮细胞及组织的增殖，包括肺、肾脏、心脏、睾丸、脾 脏、骨骼肌和大脑。同时另外一项研究显示，FGF-18是对多种细胞有效的分裂素，在肝脏和 小肠发育过程中扮演着重要的角色。Dichmann等发现，FGF-18在胚胎胰腺中显著性表达， 但其在胰腺的具体作用尚不十分清楚。此外，Shimokawa等的研究进一步强调，FGF-18与 消化系统保持平衡的相关性，并提出了提高FGF-18表达可能导致结直肠肿瘤的发生。在结 肠癌和滑膜肉瘤组织中也可以观察到FGF-18的异常增多，同时抑制结肠癌细胞的FGF-18 表达可以抑制其增长，这说明它参与了肿瘤的形成。在胚胎和产后肺，FGF-18也显著性表 达。研究认为，FGF-18在胚胎肺的发育阶段后期肺部肺泡发育中发挥着重要的作用，而不是 在形态肺分支形态发生期。在肺发育早期FGF-18的功能明确，它的信号主要通过FGFR2b， 同时FGF-18可能通过激活FGFR2c来介导。在中脑和小脑区域发育中，FGF-18具有刺激 神经胶质细胞的功能。对FGF-18突变型小鼠研究发现，它是通过与其他生长因子协同来 参与中脑活动。据Ellsworth报道，FGF-18在发育期和成人期的大脑组织内都表达。研 究认为，在短期性脑缺血大鼠模型中，FGF-18是一种有效的脑组织保护剂。同时在前神经 折叠、鳃弓、原肠胚形成相关区域也发现了 FGF-18的表达。在大脑内，FGF-18也参与特定 的左右不对称胚胎器官的发育。（Hu MC et al.Mol Cell Biol, 1998, 18(10) :6063-6074; Ohbayashi N et al. J Biol Chem, 1998, 273(29):18161-18164 ；Iwata T et al.Hum Mol Genet, 2000, 9(11):1603-1613 ；0huchi H et al. Mech Dev,2000, 95(1-2):55-66 ； Ellsworth JL et al.Osteoarthritis Cartilage, 2002，10 (4) :308-320; Ohbayashi N et al.Genes Dev, 2002，16(7):870-879 ;Shimoaka T et al. J Biol Chem, 2002, 277(9):7493-7500 ；Dichmann DS et al.Dev Dyn,2003, 226(4):663-674 ； Usui H et al. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322 (3) :887-892 ； Katoh M et al. Int J Mol Med, 2005, 16 (3) :493-496 ；Kawano M et al. J Invest Dermatol,2005, 124 (5) :877-885 ；Moore EE et al.Osteoarthritis Cartilage, 2005, 13 (7) :623-631 ；Smith SM et a I. Arch Biochem Biophys, 2007, 468(2) :244-251 ；Greco V et al.Cell Stem Cell, 2009, 4 (2) : 155-169 ； Behr B et al. Tissue Eng Part A, 2011，17 (15-16) :2061-2069 ;Plikus MV et al. J Invest Dermatol, 2012, 132(5):1321-1324 ；Long F et al. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013, 5(1) :1-20.)
[0005] 由于FGF-18的发现对于骨骼性疾病以及脱发症的治疗有着重要意义，对其研究 以及临床应用的前景日益受到人们的关注。然而，目前FGF-18蛋白表达水平低，同时很难 制备具有高活性的蛋白，这些构成了开展FGF-18基础研究和临床应用的瓶颈问题。Hu et al.利用哺乳动物细胞表达FLAG标签的FGF-18,然而，哺乳动物表达细胞更加复杂和昂贵 的，很难利用大规模发酵过程。而且，FLAG会影响FGF18的生物活性。2012年，Jeon et al.利用大肠杆菌T0P10细胞表达6XHis-FGF-18,虽然添加了 His标签有利于蛋白的纯 化，但增加了免疫原性和降低了生物活性，使其很难成为一种有效的治疗药物。
[0006] 目前国际上的FGF-18大肠杆菌表达系统生产工艺，为方便纯化都融合标签 (His，GST，Trx等）来表达目的蛋白，但这些方法来表达的蛋白具有较高的免疫原性，同时 去除融合标签既昂贵又会影响蛋白的生物活性。申请单位通过基因优化，表达载体和宿主 菌的筛选，获得大肠杆菌的高表达菌株，同时利用离子交换和肝素亲和二步柱层析技术纯 化目的蛋白，最终获得蛋白纯度超过95 %的具有较高生物学活性的重组蛋白，为今后开展 产业化生产奠定了良好基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种简便并且高效的生产FGF-18的方法。
[0008] 本发明的目的是提供一种检测FGF-18生物学活性的方法。
[0009] 本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体和宿主细胞。
[0010] 为实现上述目的，本发明首先将FGF-18的天然序列按照大肠杆菌偏好性进行优 化，在不改变其氨基酸序列的前提下，设计合成rhFGF-18的全长序列。同时，本发明提供 了筛选优化的表达载体和宿主细胞的组合，如pET3a、