下实施例中，所述氨苄霉素在培养基中的终浓度为100 μ g/ml。
[0048] 以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
[0049] 表1、引物序列
[0050] CN 105176907 A 说明书 4/5 页
[0051] 实施例1:质粒pMW-iIvGAM的构建
[0052] L 1、pMW-iIvGMEDA 的构建
[0053] 以pMW119载体（购自Nippon Gene公司）利用Hindlll/EcoRI双酶切，回收 4. Ikb片段；以MG1655基因组为模板，ilvG119F/ilvG119R为引物，PCR扩增ilvGMEDA片 段，约 9kb;上述片段进行 GIBSON 连接（参考 Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases，Daniel G Gibson, et al. Nature Methods. 2009)，得到 pMff-ilvGMEDA 质粒。
[0054] I. 2、pMff-ilvGAM 的构建
[0055] 以pMff-ilvGMEDA质粒为模板，分别以PilvGMF/ilvAMF为引物，PCR扩增yifB与 PMW119载体片段，约7kb ;以ilvGMR/ilvAMR为引物，PCR扩增ilvGMEDA部分片段，约6. 2kb ; 以ilvGMF/PilvGMR为引物，PCR扩增ilvG部分片段，约I. Ikb ;上述片段进行GIBSON连接， 得到 pMff_ilvGAM 质粒。pMff-ilvGAM 质粒参照文献（Construction of an L-Isoleucine Overproducing Strain of Escherichia coli K-12, Ken-ichi HASHIGUCHI, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 1999)中的质粒pMWD5,删除了 ilvG基因前面的阻遏蛋白基因序列， 对ilvG基因进行了重排，使其表达的蛋白具有活性，对ilvA进行了点突变，解除了异亮氨 酸的抑制作用。
[0056] 实施例2:L-异亮氨酸表达菌株的获得
[0057] 将实施例1. 2中获得的pMW-i IvGAM质粒转入到L-苏氨酸生产菌CCTCC M 2015556感受态细胞中（感受态细胞制备及转化具体方法参考《分子克隆实验指南》（第三 版），J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔（美）编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002,第1章 96页），获得了用于生产L-异亮氨酸的基因工程菌CIBTS1800,其基因型为MG1655 ( Δ tdh， Δ thrL, thrA*(G433R), Ptac-rhtC, IysC* (T342I), Δ tdcC, Δ dacA::thrA*BC, Δ yihF::thr A*BCΔ cadB::Thr, Δ yidj::Thr)/pMff-ilvGAM。
[0058] 实施例3:L_异亮氨酸基因工程菌发酵生产L-异亮氨酸
[0059] 利用L-异亮氨酸基因工程菌通过发酵生产L-异亮氨酸的方法如下所述：
[0060] 挑取单菌落接种于400 μ 1含氨苄霉素发酵培养基的96孔板中，37°C，290rpm培养 40小时。
[0061] 发酵结束，利用HPLC测定发酵液上清中的L-异亮氨酸含量，结果如表3所示。
[0062] 其中，发酵培养基组成如下：葡萄糖40g/L，（NH4)2SO 4 16g/L，KH2PO4 1.0g/L， MgSO4 · 7H20 lg/L，MnSO4 · 5H20 0· 01g/L，FeSO4 · 7H20 0· 01g/L，酵母粉 2. Og/L，CaCO3 30g/ L，余量为水，pH7. 0。HPLC检测方法如下：
[0063] 色谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18 (100mm)中性柱子、检测波长338nm、柱温： 40 cC 〇
[0064] 衍生剂配置：取0· 3430g邻苯二甲醛+5ml无水乙醇+0· 1472g N-乙酰-L半胱氨 酸，用0. 05mol/L硼酸缓冲液（pH = 9. 5)定溶到50ml，避光备用。
[0065] 流动相 A :10mmol/L Na2HPO4, lOmmol/L Na2B4O7. IOH2O,浓盐酸调 ρΗ8· 2 ;
[0066] 流动相B :甲醇：乙睛：水=45:45:10
[0067] 梯度洗脱程序如表2所示。
[0068] 表2、HPLC梯度洗脱程序
[0070] 数据采集时间18min。
[0071] 表3、基因工程菌L-异亮氨酸产量比较
[0073] 从表3的结果可见，原始菌株CCTCC M 2015556在孔板上发酵的L-异亮氨酸产量 为零；
[0074] 将重组质粒pMff-ilvGAM转入CCTCC M 2015556后所得CIBTS1800菌株在96孔 板上发酵产生了 L-异亮氨酸而无苏氨酸的残留，表明构建的pMff-ilvGAM质粒实现了原始 菌株CCTCC M 2015556中产物苏氨酸向异亮氨酸的转化，达到了利用大肠杆菌发酵法生产 L-异亮氨酸的目的。L-异亮氨酸的产量为16. 05±0. 16g/L，糖酸转化率达40. 78%，表明 菌株能有效地生产L-异亮氨酸。因此，作为L-异亮氨酸生产菌，CIBTS1800菌株是较理想 的菌株，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015557。
[0075] 综上所述，本发明所构建的L-异亮氨酸基因工程菌在发酵过程中能够实现发酵 液中L-异亮氨酸的有效积累，具有较高的L-异亮氨酸产量及糖酸转化率，生产成本低，具 有广泛的工业应用前景。
【主权项】
1. 一种L-异亮氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2015557。2. 如权利要求1所述的L-异亮氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 以L-苏氨酸基因工程生产菌CCTCCM2015556作为原始菌株； B. 构建包含大肠杆菌MG1655基因簇ilvGMEDA的重组质粒，该基因簇ilvGMEDA包含 编码解除L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的 ilvGMEDA操纵子； C. 将步骤B中所述重组质粒导入步骤A中所述原始菌株中，获得L-异亮氨酸生产菌。3. 如权利要求1所述的L-异亮氨酸生产菌在生产L-异亮氨酸中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述的L-异亮氨酸生产 菌的发酵来生产L-异亮氨酸。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：葡萄糖40g/L， (NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4I.Og/L，MgSO4 ? 7H20lg/L，MnSO4 ? 5H20 0? 01g/L，FeSO4 ? 7H20 0? 01g/L，酵母粉 2.Og/L，CaCO3 30g/L，余量为水，pH7. 0。
【专利摘要】本发明通过基因工程构建了一种L-异亮氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？M？2015557。该L-异亮氨酸生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中L-异亮氨酸的有效积累，具有较高的L-异亮氨酸产量及糖酸转化率，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。CCTCC NO:M 201555720150918
【IPC分类】C12N1/21, C12R1/19, C12P13/06
【公开号】CN105176907
【申请号】
【发明人】杨晟, 蒋宇, 陈飚
【申请人】上海工业生物技术研发中心, 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月20日