L-异亮氨酸基因工程生产菌的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种L-异亮氨酸基因工程生产 菌。
【背景技术】
[0002] L-异亮氨酸，化学名为L-α -氨基-γ-甲基戊酸，是一种天冬氨酸族非极性、输水 性的氨基酸，也是人体必需八种氨基酸之一，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果。成年 人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重）的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、 饲料和运动保健领域具有广泛的商业价值。
[0003] 由于异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以用化学合成方法生产比较困难，成本 很高。生物转化制造 L-异亮氨酸是将a氨基丁酸和a-氧代丁酸等作为前体原料进行生 物合成，但由于原料昂贵，同样存在生产成本过高的问题。通过发酵来生产L-异亮氨酸是 一种发展趋势。日本味之素1995年申请的中国专利CN1117524A中，利用大肠杆菌，通过导 入质粒来增强前体苏氨酸合成、以及异亮氨酸代谢途径上相关解除抑制的基因的表达，使 得异亮氨酸产率达〇. 30g/g(葡萄糖，糖酸转化率为30% )。江南大学2014年申请的专利 CN104480057A中，利用谷氨酸棒杆菌，通过质粒表达异亮氨酸合成的基因簇，并增加质粒的 稳定性，使得异亮氨酸产率达〇. 124g/g(葡萄糖，糖酸转化率为12. 4% )。
[0004] 目前，国内己有厂家进行批量生产L-异亮氨酸，但是这些厂家采用的菌株的产酸 能力都较低，产量不能满足市场需求。因此，改善菌株生产能力、优化工艺流程、配备先进设 备成为本领域亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有L-异亮氨酸生产技术的上述缺陷，得到理想的L-异亮氨酸生产菌， 本发明利用基因工程技术来改造大肠杆菌，通过增强相关基因，获得一株高产L-异亮氨酸 的生产菌株，其发酵过程中能有效地积累L-异亮氨酸，从而降低生产成本，具有广阔的工 业应用前景。
[0006] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-异亮氨酸基因工程生产菌。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供一种L-异亮氨酸基因工程生产菌的构建方法。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供所述L-异亮氨酸基因工程生产菌用于生产L-异亮 氨酸的应用。
[0009] 为了达到上述目的，本发明对于大肠杆菌中与L-异亮氨酸代谢途径相关的基因 进行了系统的研究和筛选，并且设计出包括如下步骤的基因工程菌构建方案：
[0010] A.以L-苏氨酸基因工程生产菌CCTCC M 2015556作为原始菌株，其特征包括： 敲除了基因 tdh、tdcC 和 thrL，增强了基因 thrA*BC(G433R)和 rhtC，并且基因 ppc、aspA、 pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)在基因组中以多个拷贝的形式存在；
[0011] B.构建包含大肠杆菌MG1655基因簇ilvGMEDA的重组质粒，该基因簇包含编码 解除L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的 i IvGMEDA操纵子；
[0012] C.将步骤B中所述重组质粒导入步骤A中所述原始菌株中，获得L-异亮氨酸生产 菌。
[0013] 通过上述基因工程构建和筛选，得到一种高产L-异亮氨酸的菌株，现保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015557。
[0014] 根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌CCTCC M 2015557在生产L-异 亮氨酸中的应用。
[0015] 在上述应用中，通过上述基因工程菌CCTCC M 2015557的直接发酵生产L-异亮氨 酸。
[0016] 根据本发明的优选实施例，发酵培养基组成如下：葡萄糖40g/L，（NH4) 2SO4 16g/ L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，MnSO4 · 5H20 0· 01g/L，FeSO4 · 7H20 0· 01g/L，酵母粉 2. Og/L，CaCO3 30g/L，ρΗ7· 0。
[0017] 本发明所构建的L-异亮氨酸生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中L-异亮氨酸 的有效积累，提高了 L-异亮氨酸的产量及糖酸转化率，L-异亮氨酸产量可高达16. 31g/L， 糖酸转化率达40. 78%，因而具有广泛的工业应用前景。
[0018] 本发明构建的L-异亮氨酸生产菌的拉丁学名是Escherichia coli，中文名称是 大肠杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2015年9月18日，保藏地址为 湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2015557。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明构建的重组质粒pMff-ilvGAM的示意图，可过表达解除抑制型 iIvGMEDA 基因。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说 明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0021] 本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明 外，皆指质量百分含量。
[0022] 在本文中，当用于本发明时，术语"L-异亮氨酸基因工程生产菌"、"L-异亮氨酸 生产菌"、"基因工程菌"、"L-异亮氨酸基因工程菌"、"生产L-异亮氨酸的基因工程菌"、 "CIBTS1800菌株"、"大肠杆菌CIBTS1800"表示相同的意义，都是指L-异亮氨酸生产菌 CCTCC M 2015557。
[0023] 本发明中涉及的基因名称解释如下：
[0024] tdh :L-异亮氨酸3-脱氢酶；
[0025] thrL :异亮氨酸操纵子前导肽；
[0026] thrA :天冬氨酸激酶及I -高丝氨酸脱氢酶；
[0027] rhtC :异亮氨酸转运体；
[0028] IysC :天冬氨酸激酶；
[0029] tdcC :L-异亮氨酸/L-丝氨酸转运体；
[0030] dacA :D_丙氨酰-D-丙氨酸駿肽酶；
[0031] thrB:高丝氨酸激酶；
[0032] thrC :异亮氨酸合成酶；
[0033] yihF :DU945 家族蛋白；
[0034] ppc :磷酸烯醇式羧化酶；
[0035] aspA :天冬氨酸氨裂解酶；
[0036] pntAB :吡啶核苷酸转氢酶；
[0037] cadB:赖氨酸：尸胺反向转运体；
[0038] yidj:假定的硫酸脂酶；
[0039] iIvG :乙酰乳酸合成酶；
[0040] iIvM :乙酰乳酸合成酶II ;
[0041] ilvE :支链氨酸转移酶；
[0042] i IvD :二羟基酸脱水酶；
[0043] i IvA:苏氨酸脱氢酶。
[0044] 根据大肠杆菌中L-异亮氨酸的代谢途径，本发明在苏氨酸基因工程生产菌CCTCC M 2015556基础上，构建载体组合表达ilvGMEDA基因簇，该基因簇包含编码解除L-异亮氨 酸抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因且除去了减弱作用所必需的区域的ilvGMEDA操纵子， 构建出L-异亮氨酸基因工程菌。
[0045] 至于表达ilvGMEDA的载体的构建方法，参考Ken-ichi HASHI⑶CHI等报道的文 献（Construction of an L-Isoleucine Overproducing Strain of Escherichia coli K-12，Ken-ichi HASHI⑶CHI, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 1999)。
[0046] 实施例
[0047] 以