5°C 5min ;95°C 30s， 55°C 30s，72°C I. 5min，30个循环；72°C lOmin。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上 海生工生物工程有限公司测序，得到HMB27688的16S rDNA序列（见SEQ ID No:3)。将所 得HMB27688的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB27688与芽孢杆 菌属的16S rDNA同源性达到99% ;构建系统发育树（见图I)，HMB27688与芽孢杆菌属聚 合到一起，说明HMB27688属于芽孢杆菌属（Bacillus)。
[0040] (3)利用gyrB基因序列鉴定分类
[0041] 以HMB27688基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和 gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物的序列为：
[0042] gyrB-F :5' TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3' ；（SEQ ID No:4)
[0043] gyrB-R :5, TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3, ；（SEQ ID No:5)
[0044] gyrB 的 PCR 扩增反应体系为 50yL:10XPCR Buffer(Mg2+)5yL ;dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L ;Taq (5U/μ L)1 μ L ;gyrB_F (10 μ mol/L)1 μ L，gyrB-R(10 μ mol/ L)lyL;HMB27688 基因组 DNA 50ng;ddH20 补足至 50yL。PCR 的反应条件为 95°C5min; 95°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，30个循环；72°C 10min。将扩增产物送交上海生工生物工程 有限公司测序，得HMB27688菌株的gyrB基因序列（见SEQ ID No:6)。将获得的HMB27688 菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，同时利用MEGA软件（Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析）构建系统发育树。结果发现 HMB27688与解淀粉芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高；构建系统发育树（见图2)， HMB27688菌株与解淀粉芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB27688为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，并且是一个新菌株。
[0045] 综合以上形态特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知 HMB27688属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)，并且和现有的解淀粉芽孢 杆菌菌株不同，是一个新菌株。
[0046] 上述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27688的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为 模板，以F27和R1492为引物对进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No: 3所示 的核苷酸序列，即为HMB27688菌株。
[0047] 上述解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27688的鉴定方法，包括以待测菌株的基因组DNA为 模板，以gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No: 6所 示的核苷酸序列，即为HMB27688菌株
[0048] 上述微生物菌剂的鉴定方法，包括以待测菌剂中提取的基因组DNA为模板，以F27 和R1492为引物对进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID No: 3所示的核苷酸序 列，即为HMB27688微生物菌剂；或以待测菌剂中提取的基因组DNA为模板，以gyrB-F和 gyrB-R为引物进行PCR扩增，如果所得PCR扩增产物为SEQ ID N〇:6所示的核苷酸序列，即 为HMB27688微生物菌剂。
[0049] 本发明具有的优点和有益效果：（1)本发明为防治番茄灰霉病提供了一个高效的 微生物，开辟了一个新的防治途径；(2)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉病的 药效高，平均防效在80. 0%以上，且针对性强；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，属于环 境友好型；(4)利用本发明方法防治番茄灰霉病不易产生抗药性；（5)本发明制备方法简 单、成本低、使用简单。
【附图说明】
[0050] 图1.为根据16S rDNA序列获得的HMB27688菌株的系统发育树图。
[0051] 图2.为根据gyrB基因序列获得的HMB27688菌株的系统发育树图。
【具体实施方式】
[0052] 下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明 的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含 量，如无特别说明，均为重量百分含量。
[0053] 实施例1HMB27688微生物菌剂的制备
[0054] 按照如下步骤进行：
[0055] (1)菌种活化：将保存于_80°C的菌株HMB27688 (解淀粉芽孢杆菌菌株HMB27688 己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为CGMCC No. 11457)在LB平板培养基（其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000 mL)上在30°C进行活化，挑取单菌落在LB斜面培 养基（其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水 1000 mL)上在30°C下培养12小时，得活化的菌株。
[0056] (2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基（其组成成分及其重量比为： 胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000 mL)，在250mL三角瓶中装入LB液体培养 基100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤（1)中活化的菌株， 在30°C、摇床转速ISOrpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液。
[0057] (3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1. 5%，黄豆粉2. 0%， NaCl 0. 5%，MnSO4 · H2O 0. 6%加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于 500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到 30°C备用。
[0058] (4)发酵培养：向步骤（3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤（2) 所得种子液2mL ;在30°C、摇床转速ISOrpm条件下进行发酵培养36小时，以后每隔30分钟 从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率（芽胞率 (%)=成熟芽胞数八成熟芽胞数+菌体数）X100);芽胞率达到90%时停止发酵培养；共 发酵培养48h，得解淀粉芽孢杆菌HMB27688的液体制剂。
[0059] 实施例2解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉菌的拮抗作用试验
[0060] ( -）试验时间和地点：2013年8月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植 物病害生物防治实验室内进行。
[0061] (二）试验方法：
[0062] (1)供试番茄灰霉菌来源：番茄灰霉菌BC-I菌株采自河北省保定市容城县东牛东 庄村番茄病果，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学 院植物病理系鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)，致病力测定表现为强致病力。
[0063] (2)平板对峙实验：
[0064] 首先将番茄灰霉菌BC-I在PDA平板上活化，培养4天后在菌落边缘区域，用打孔 器（0=6mm)打孔制成菌片，将番茄灰霉菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例 1步骤⑴中活化的解淀粉芽孢杆菌HMB27688点接在距指示菌菌片2. 0厘米处，设空白对 照（不点接HMB27688菌株的番茄灰霉菌生长情况）。25°C恒温培养，待空白对照即将长满 整个培养皿时，测量番茄灰霉菌的对照生长量（菌落半径）和处理生长量（接种HMB27688 后的抑制生长半径），拮抗作用用抑菌率表示。计算公式为：
[0065] 抑菌率（％) =(对照生长量-处理生长量）/对照生长量X 100
[0066] 结果（见表1)解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉菌的抑制率达88. 16% ;透 明的抑菌带宽11. 5毫米；说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB27688对番茄灰霉菌抑菌性强，具 有防治番茄灰霉病的生防潜力。
[0067] 表1HMB27688菌株对番茄灰霉菌的拮抗作用试验结果
[0069] 实施例3解淀粉芽孢杆菌HMB27