一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物防治领域，具体涉及一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆 菌，以及含有该解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，还涉及它们在防治番茄灰霉病上的应用。
【背景技术】
[0002] 番前灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.)引起的一种重要病害。该 病害主要危害果实，造成果实腐烂，也危害叶、茎和花，番茄减产可达20%~50%，损失严 重；该病发病后传播速度非常快，严重威胁保护地番茄生产。其病原菌寄主范围较广，除侵 染茄科蔬菜外，还可侵染瓜类、甘蓝、菜豆、莴苣、洋葱、苹果等作物。
[0003] 目前，对番茄灰霉病的主要防治方法有：一是化学防治。化学防治虽有见效快、效 率高等优点，但是因长期使用会造成环境污染、危害害虫的天敌等缺点，因此逐步被淘汰； 其次是生物防治，由于生物防治药效高、持效期长、不易产生抗药性、环境友好等优点日益 受到人们的青睐。
[0004] 芽孢杆菌（Bacillius sp)是一种受到广泛关注的生防细菌，以其分布广、易分 离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微 生物。因芽孢杆菌能产生内生芽孢，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有 利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制 作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)是用于防治番前灰霉病的芽孢杆菌之一，目前，用于防治番前灰霉 病的解淀粉芽孢杆菌主要有CGMCC No. 4777(专利号：ZL201210059785.0)、BA-KA3(专 利【申请号】201410618581. 5)、SZ23(专利【申请号】201410683826. 2)、LH-I (专利【申请号】 201410735508. 6)和NCPSJ17(专利【申请号】201310112580. 9)等。由于病原菌的多样性和 同步进化特性，因此需要寻找不同的新菌株防治番茄灰霉病。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高 效、广谱杀菌活性优点。
[0006] 本发明第二目的在于提供一种利用上述解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂。
[0007] 本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
[0008] 本发明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株在防治番茄灰霉病上的用途。
[0009] 本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的用途。
[0010] 本发明第六目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株的鉴定方法。
[0011] 本发明第七目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。
[0012] 本发明通过以下技术方案实现：
[0013] 一种解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 HMB27688,己于 2015 年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No. 11457。
[0014] 利用上述解淀粉芽孢杆菌HMB27688生产的微生物菌剂，其活性成分为HMB27688 菌体。
[0015] 上述微生物菌剂可以为液体制剂。
[0016] 上述微生物菌剂，其中HMB27688的活菌数大于18. OX 10scfu/mL。
[0017] 上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0018] (1)菌种活化：将低温保存的HMB27688菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落 在LB斜面培养基上25~35°C培养10~16小时，得活化的菌株；
[0019] (2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤（1)活化的菌株接种到IOOmL LB 液体培养基中，在25~35°C、摇床转速为150~220rpm的条件下培养10~16小时，得种 子液；
[0020] (3)发酵培养：按照体积比为1~3%的比例将步骤⑵的种子液接入到玉米粉 黄豆粉培养基中，在温度为25~35°C、摇床转速为150~220rpm的条件下发酵培养40~ 50h，得发酵液；
[0021] (4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的 90%时停止发酵培养；所得即为腿827688菌株的液体制剂。
[0022] 所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。
[0023] 上述制备方法步骤（1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基，其组成成分及 其重量比为：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化钠4~6g，琼脂粉12~18g，水 1000 mL0
[0024] 上述制备方法步骤（2)中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋 白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化钠4~6g，水1000mL。
[0025] 上述制备方法步骤（3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分 比为：玉米粉 1.0 ~3.0%，黄豆粉 LO ~3.0%，NaCl 0.1 ~1.0%，MnSO4* H2O 0.5 ~ 1.0%，其余为水；pH值为7. 2。
[0026] 所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl 和MnSO4 · H2O混合，再加水，调节pH搅拌均勾即可。
[0027] 上述解淀粉芽孢杆菌HMB27688在防治番茄灰霉病上的应用。
[0028] 上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的应用。
[0029] 本发明微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为 107cfu/mL，于番前灰霉病发病前进行叶面喷雾即可。
[0030] HMB27688菌株的筛选分离过程
[0031] HMB27688菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市的棉田土壤 中分离得到。2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市棉田中五点采 集土样，混匀后称取Ig放到250mL的灭菌三角瓶中，加入IOOmL无菌水，放到摇床上，170r/ min振荡30min，静置2h，取上清液IOmL加入50mL灭菌离心管中，在80°C恒温水浴30分钟， 然后取ImL加无菌水9mL，即成IOmLlO 3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10 4、 10 5、10 6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200 μ L涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次， 在30°C恒温培养ld-3d，进行细菌的分离和纯化。并以番茄灰霉病为靶标，通过平板对峙 法、离体叶片法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对番茄灰霉病具有明 显防治效果的菌株，定名为HMB27688。
[0032] HMB27688菌株的分类鉴定：
[0033] (1)形态特征鉴定
[0034] 在LB培养基上培养菌体为杆状，培养IOh后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不 膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡 乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘 不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培 养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著.科学 出版社.2001年）中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27688属于芽 孢杆菌属（Bacillus)。
[0035] (2)利用16S rDNA序列鉴定分类
[0036] 以HMB27688的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR 扩增，所述的引物序列为：
[0037] F27 :5, AGAGTTTGATCATGGCTCAG3, ；（SEQ ID No: 1)，
[0038] R1492 :5' GGCTACCTTGTTACGACTT3' ；（SEQ ID No:2);
[0039] 16S rDNA 的扩增反应体系为 50yL:10XPCR Buffer(Mg2+)5yL ;dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L ;Taq(5U/μ L)1 μ L，F27(10 μ mol/L) 1 μ L，R1492(10 μ mol/L) 1 μ L ; HMB27688 的基因组 DNA 50ng ;ddH20 补足至 50 yL。PCR 的反应条件为 9