>[0057] TCCTTGCCGGCATGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGAT TTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAA ACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGG ATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGG GTAATCGGCCAC ATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGA CGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACAT ATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGA AAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGT GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGG CTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAG GGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAA AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT TGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCA CTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC TACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAG TTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTA GGAACCAGCCGCCTAATGTGACAT
[0058] 将此序列在NCBI进行BLAST比对，与之相似度达99%的菌株均为乳杆菌；选取相 似度达99%的部分序列和其它乳杆菌的16S rDNA序列，经多重序列比对，用软件MAGE 4.1 按Neighbor-Joining法构建系统发育树。结果是该菌与清酒乳杆菌同源性最高。综合以 上结果，认为LZ217为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei)。
[0059] 实施例2 :菌株的培养
[0060] 清酒乳杆菌 LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)的培养方法，
[0061] 种子培养
[0062] 将清酒乳杆菌LZ217接入灭菌后的MRS液体培养基中，于37°C培养24h，得到种子 液；
[0063] 发酵培养
[0064] 将种子液按接种量5% -10%，接种到发酵培养基中进行发酵，所述发酵培养基包 括葡萄糖为20g，酵母浸膏为35g，吐温80为lmL，碳酸钙5g，磷酸二氢钾I. 5g，磷酸氢二钾 2g，蒸馏水1000 mL ;培养条件为温度35-37°C，通气量l-2vvm，转速200-250rpm，发酵时间 24-36h。
[0065] 实施例3 :
[0066] 菌株产细菌素的鉴定
[0067] 将实施例2得到的发酵液，在4°C、1000 Orpm离心15min，得到细菌素粗提液。将该 细菌素命名为清酒乳杆菌素 LZ217。
[0068] 除细菌素外，清酒乳杆菌LZ217在其生长过程中通过代谢还可以产生其他抑菌物 质，如一些有机酸、过氧化氢和双乙酰等，因此在筛选时就要排除这些抑菌物质的干扰，从 而能确定是清酒乳杆菌LZ217细菌素起到的抑菌作用。
[0069] 在排除上述干扰之后，选择食品中9种常见的革兰氏阳性细菌、6种革兰氏阴性细 菌和1种酵母菌作为指示菌，观察细菌素的抑菌情况。
[0070] 表1清酒乳杆菌素 LZ217的抑菌谱
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[0072] 抑囷圈直径（mm) :+++，15_20 ;++，10_15 ;+，5_10 ;_，无抑囷效果
[0073] 采用牛津杯双层平板法检测清酒乳杆菌LZ217菌株产生的抗菌物质对各种革兰 氏阳性和革兰氏阴性细菌的抑制活性。结果发现细菌素粗提液能够有效抑制多种食品腐败 和致病革兰氏阳性细菌。其抑菌谱很广，其中对柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏的抑制作 用非常明显，对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌等致病菌也有较强 的抑制作用，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，属于广谱性细菌素。
[0074] 虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技 艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当 视权利要求书所要求保护的范围为准。
[0075] 核苷酸序列表
[0076]
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【主权项】
1. 一株清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)，保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO. 10259。2. 如权利要求1所述的清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)在制备细菌 素中的应用。3. 如权利要求1清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)的筛选方法，其特 征在于， 首先，清酒乳杆菌LZ217的分离，取生鲜牛乳用生理盐水以10倍梯度稀释，将每个稀释 梯度分别涂布于含清酒乳杆菌LZ217筛选培养基的平板上，37°C倒置无氧培养； 选择长势良好形态不同且钙溶圈大的菌落进行编号，并通过平板划线分离法反复分离 纯化，挑取平板上的清酒乳杆菌LZ217单菌落，接种到MRS液体培养基中，培养编号保藏； 其次，产抑菌活性代谢产物的清酒乳杆菌LZ217筛选，分别挑取分离出来的产酸菌株 接种至MRS液体培养基中，培养24h后离心取上清液待用； 以柠檬色葡萄球菌为指示菌，检测是否有抑菌圈，以此来分离有抑菌活性的清酒乳杆 菌LZ217 ; 将实验分离所得的清酒乳杆菌LZ217菌株接种到MRS液体培养基中，接种到MRS液体 培养基中，培养编号保藏。4. 如权利要求1清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)的培养方法，其特 征在于，包括以下步骤： 步骤a，种子培养 将清酒乳杆菌LZ217接入灭菌后的MRS液体培养基中，于37°C培养24h，得到种子液； 步骤b，发酵培养 将步骤a得到的种子液按接种量5%-10%，接种到发酵培养基中进行发酵，所述发酵培 养基包括葡萄糖为20g，酵母浸膏为35g，吐温80为lmL，碳酸钙5g，磷酸二氢钾I. 5g，磷酸 氢二钾2g，蒸馏水1000 mL;培养条件为温度35-37°C，通气量l-2vvm，转速200-250rpm，发 酵时间24-36h。5. 如权利要求1所述的清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)在制备食品 或饲料防腐剂中的应用。6. 如权利要求1所述的清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)在制备绿色 生物兽药的应用。7. 如权利要求1所述的清酒乳杆菌LZ217(LactobacillussakeiLZ217)在制备细菌 抑制剂中的应用，所述细菌为柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏，藤黄微球菌、金黄色葡萄球 菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌。
【专利摘要】本发明提供了一株清酒乳杆菌<i>LZ</i>217<i>Lactobacillus？sakeiLZ</i>217，及利用该微生物生产细菌素的应用。所述清酒乳杆菌<i>LZ</i>217发酵产生的细菌素属于广谱性细菌素，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，如恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、福氏志贺氏菌、柠檬色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等。CGMCC NO.1025920141229
【IPC分类】C12P21/00, A61K35/747, A61P31/04, A23L3/3571, C12R1/225, C12N1/20, C12Q1/04
【公开号】CN105176856
【申请号】
【发明人】顾青, 顾容铖, 宋达峰, 沈雷
【申请人】浙江工商大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年5月19日