一种清酒乳杆菌lz217筛选和培养方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)，及利用该微生 物生产细菌素的应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素是由乳杆菌产生的一种耐高温、耐酸、在人体中可降解、安全无毒，且具有 较强抑菌活性的抗菌短肽。细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活 性的蛋白质或低分子量多肽物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素 具有自身免疫性。
[0003] 细菌素作为一种特殊的抗菌抑菌蛋白质，具有抑菌活性强、生物相容性好、性能稳 定、可生物降解、可消化吸收、生物安全性高的特点，在预防及治疗畜禽疾病、生产绿色生物 饲料添加剂和生物兽药领域具有广阔的开发应用前景。
[0004] 而工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的最主要因素有 三个：生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。 因此从自然界中寻找性能优秀的菌株成为一项十分重要的工作。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服现有技术不足，提供清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)，该菌株发酵生产的细菌素为广谱抗菌素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑 囷效果。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -株清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)，保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO. 10259,保藏地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，保藏时间2014年12月29日。
[0008] 该新菌株特征如下：
[0009] 菌落形态：37°C在MRS固体培养基平板培养24h，菌落呈圆形，直径1~3mm，隆起 或微隆起，乳白色，边缘整齐，光滑有光泽，不透光，质地易挑起。
[0010] 细胞形态：24h培养物的细胞呈短杆状。
[0011] 生理特征：革兰氏阳性，在好氧和厌氧条件下都能生长，在厌氧条件下菌体生长情 况的更好些，属于兼性厌氧菌。不耐高温，最适生长温度为37°c。
[0012] 在pH值为4. 0的MRS液体培养基中生长旺盛，而在pH值为10. 0的MRS液体培养 基中几乎不生长。
[0013] 在含1% -10% NaCl梯度的MRS液体培养基中均能生长，最适NaCl浓度为2%。
[0014] 生化特征：过氧化氢酶阴性，精氨酸产氨为阳性，葡萄糖产酸产气和葡萄糖酸钠产 酸产气试验均为阳性，可水解七叶苷，不能水解淀粉乙酰甲基甲醇（V-P)试验，硫化氢产生 试验，可水解精氨酸，可产生葡聚糖。
[0015] 如权利要求1清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)的筛选方法，包括 以下步骤：
[0016] 首先，清酒乳杆菌LZ217的分离，取生鲜牛乳用生理盐水以10倍梯度稀释，将每个 稀释梯度分别涂布于含清酒乳杆菌LZ217筛选培养基的平板上，37°C倒置无氧培养。选择 长势良好形态不同且钙溶圈大的菌落进行编号，并通过平板划线分离法反复分离纯化，挑 取平板上的清酒乳杆菌LZ217单菌落，接种到MRS液体培养基中，培养编号保藏；
[0017] 其次，产抑菌活性代谢产物的清酒乳杆菌LZ217筛选，分别挑取分离出来的产酸 菌株接种至MRS液体培养基中，培养24h后离心取上清液待用；
[0018] 以柠檬色葡萄球菌为指示菌，检测是否有抑菌圈，以此来分离有抑菌活性的清酒 乳杆菌LZ217 ;
[0019] 将实验分离所得的清酒乳杆菌LZ217菌株接种到MRS液体培养基中，接种到MRS 液体培养基中，培养编号保藏。
[0020] 清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)的培养方法，包括以下步骤：
[0021] 步骤a，种子培养
[0022] 将清酒乳杆菌LZ217接入灭菌后的MRS液体培养基中，于37°C培养24h，得到种子 液；
[0023] 步骤b，发酵培养
[0024] 将步骤a得到的种子液按接种量5% -10%，接种到发酵培养基中进行发酵，所 述发酵培养基包括葡萄糖为20g，酵母浸膏为35g，吐温80为lmL，碳酸钙5g，磷酸二氢 钾I. 5g，磷酸氢二钾2g，蒸馏水1000 mL ;培养条件为温度35-37°C，通气量l-2vvm，转速 200-250rpm，发酵时间 24-36h。
[0025] 前述清酒乳杆菌LZ217(Lactobacillus sakei LZ217)在制备细菌素中的应用。
[0026] 前述清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)在制备食品或饲料防腐剂 中的应用。
[0027] 前述清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)在制备绿色生物兽药的应 用。
[0028] 前述清酒乳杆菌LZ217 (Lactobacillus sakei LZ217)在制备细菌抑制剂中的应 用，所述细菌为柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏，藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、 恶臭假单胞菌。
[0029] 本发明的有益效果主要体现在：从新鲜牛乳中筛选得到一株产细菌素清酒乳杆菌 LZ217,通过酸排除实验和蛋白酶敏感实验，确定菌株所产的抑菌物质具有蛋白质性质，初 步确定这种抑菌物质为细菌素。
[0030] 本发明的清酒乳杆菌LZ217菌株产生细菌素粗提液能够有效抑制多种食品腐败 和致病革兰氏阳性细菌。其抑菌谱很广，其中对柠檬色葡萄球菌、单增李斯特氏的抑制作用 非常明显，对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌等致病菌也有较强的 抑制作用，抑菌谱包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，属于广谱性细菌素。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0032] 实施例1 :
[0033] 清酒乳杆菌LZ217的分离
[0034] 取生鲜牛乳用0.9%的生理盐水以10倍梯度稀释，将每个稀释梯度分别吸取 0. 3ml涂布于含清酒乳杆菌LZ217筛选培养基的平板上，37°C倒置无氧培养36~48h。选 择长势良好形态不同且钙溶圈大的菌落进行编号，并通过平板划线分离法反复分离纯化， 挑取平板上的清酒乳杆菌LZ217单菌落，接种到MRS液体培养基中，37 °C恒温培养24h，然后 编号保种，一 80°C保藏菌株。
[0035] 产抑菌活性代谢产物的清酒乳杆菌LZ217筛选
[0036] 分别挑取分离出来的产酸菌株各3环接种至MRS液体培养基中，37°C培养24h。 在4°C、1000 Orpm离心15min，用pH酸度计测量发酵上清液pH值，样品待用。
[0037] 以柠檬色葡萄球菌为指示菌，将柠檬色葡萄球菌液体培养24h，稀释成108CFU/mL 的菌液，取此菌液300 μ L与IOmL融化后保持在45°C的LB上层半固体培养基混匀后立即倒 入素琼脂平板上，待平板凝固后均匀地放上灭过菌的牛津杯，取发酵上清液200 μ L注入牛 津杯，37°C培养16h后检测是否有抑菌圈。
[0038] 将实验分离所得的清酒乳杆菌LZ217菌株接种到MRS液体培养基中，37°C恒温培 养24h，然后编号保种，一 80°C保藏菌株。
[0039] (2)鉴定
[0040] 菌落形态：37°C在MRS固体培养基平板培养24h，菌落呈圆形，直径1~3mm，隆起 或微隆起，乳白色，边缘整齐，光滑有光泽，不透光，质地易挑起。
[0041] 细胞形态：24h培养物的细胞呈短杆状。
[0042] 生理特征：
[0043] 1)氧气利用试验
[0044] 清酒乳杆菌LZ217在好氧和厌氧条件下都能生长，在厌氧条件下菌体生长情况的 更好些，属于兼性厌氧菌。
[0045] 2)温度生长试验
[0046] 清酒乳杆菌LZ217经过24h的培养观察发现在4°C，15°C，30°C，37°C，45°C条件下 都能生长，在60°C的条件下不能生长。最适生长温度为37°C。
[0047] 3) pH耐受性试验
[0048] 清酒乳杆菌LZ217在pH值为4. 0的MRS液体培养基中生长旺盛，而在pH值为10. 0 的MRS液体培养基中几乎不生长。
[0049] 4)耐盐性试验
[0050] 清酒乳杆菌LZ217在含1 % -10% NaCl梯度的MRS液体培养基中均能生长，最适 NaCl浓度为2%。
[0051] 生化特征：
[0052] 根据过氧化氢酶试验、精氨酸产氨试验、葡萄糖及葡萄糖酸盐产酸产气试验、七叶 苷（灵）水解试验、乙酰甲基甲醇（V-P)试验、H2S产生试验、淀粉水解试验、精氨酸水解试 验、葡聚糖产生试验等实验，对清酒乳杆菌LZ217进行了生化特性分析。
[0053] 过氧化氢酶阴性，精氨酸产氨为阳性，葡萄糖产酸产气和葡萄糖酸钠产酸产气试 验均为阳性，可水解七叶苷，不能水解淀粉乙酰甲基甲醇（V-P)试验，硫化氢产生试验，可 水解精氨酸，可产生葡聚糖。
[0054] I6SrDNA 测序结果：
[0055] 本发明的清酒乳杆菌LZ217总DNA在0. 7%琼脂糖凝胶下电泳结果，可见其总DNA 条带的大小在20kb左右，符合清酒乳杆菌LZ217总DNA的大小。以清酒乳杆菌LZ217的总 DNA为模板，用16S rDNA引物进行PCR扩增，得到的1481bp特异性扩增产物。
[0056] 菌株LZ217的基因组DNA，以该基因为模板扩增出一条约为1500bp长的DNA条带， 割胶纯化经上海生工生物工程有限公司测得有效序列为1468bp，基因序列（SEQ ID N0:1) 如下所示：