中，继续 振荡培养24小时至培养液中长满菌丝球得到二级菌株培养物； 第三步，三级菌种扩大培养：在无菌条件下，将二级菌种培养物的菌种按体积比菌株： 固体培养基为1:15的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20 °C至23 °C、相对湿度 为70%至85%条件下培养15d，直到固体培养基上全部长满白色菌丝。
[0036] 实施例4,作为实施例3的优选，第三步中固体培养基的配制方法为：按重量百分 比计，将麦麸68%、米糠30%、黄豆粉1%和奶粉1%混匀，并加入麦麸、米糠、黄豆粉和奶粉总 重量70%的水，搅拌均匀，灭菌即得。
[0037] 球孢白僵菌XNBb-04菌株对苜蓿根瘤象甲的致病力测定。
[0038] 生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能 为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就球孢白僵菌XNBb-04菌 株对苜蓿根瘤象甲的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。
[0039] 供试昆虫与寄主植物：苜蓿根瘤象甲，采集苜蓿田间的苜蓿根瘤象甲成虫，室内饲 养3d后，剔除死虫、病虫，备用。供试寄主植物为紫花苜蓿。
[0040] ( 1)供试菌株的处理 经纯化后获得的球孢白僵菌XNBb-04菌株，采用PDA平板，于26士 0. 5°C的恒温箱 (N:D=14:10)中培养20天，加入质量浓度为0. 1%吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮 液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子 悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再分别配成IX 1〇\ IX 10s、IX IO9个孢子/mL 3个浓度梯度孢子悬液待用。
[0041] (2)菌株对苜蓿根瘤象甲的致病力测定 将不同浓度孢子悬液喷洒于苜蓿根瘤象甲上，对照喷洒无菌水，3天后开始计量苜蓿根 瘤象甲死亡数目，每种浓度的孢子悬浮液处理为10头，4次重复。将苜蓿根瘤象甲和苜蓿叶 片一起置于26士 0.5°C的光照培养箱中（N:D=14:10)。至16天后计算试虫死亡率。
[0042] (3)球孢白僵菌XNBb-04菌株对苜蓿根瘤象甲的累计死亡率 接种后的第4d，各处理区的幼虫开始表现出发病症状，如苜蓿根瘤象甲的体色由灰黑 色逐渐变为白色，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现白色 的孢子，最后苜蓿根瘤象甲死亡。表4为球孢白僵菌XNBb-04菌株悬液处理后苜蓿根瘤象 甲成虫第4(1、8(1、12(1、16(1的累计死亡率，结果表明随着菌液浓度的增加，苜蓿根瘤象甲成 虫的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，苜蓿根瘤象甲的死亡率也增加。
[0043] 表4不同浓度的球孢白僵菌对苜蓿根瘤象甲的累计死亡率 在喷菌4 d后开始，有部分的成虫表现出感病反应，行动迟缓、进食明显减少或不进食 的特征，随后开始出现死亡、僵化。表4为白僵菌对苜蓿根瘤象甲的致病力测定结果，表明 球孢白僵菌XNBb-04处理苜蓿根瘤象后的校正死亡率随着处理浓度和处理时间的增加而 增加，当处理浓度为1. 65 X IO9个孢子/mL，处理时间为16天时校正死亡率达到100%。
[0044] 本发明提供一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，属半知菌门，丛梗孢目，丛梗孢科，白 僵菌属。球孢白僵菌XNBb-04菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，能够进一步制备活体 生物农药，由上述实施例可知，本发明的球孢白僵菌对苜蓿根瘤象甲虫有较好致病力作用， 能够有效杀死苜蓿根瘤象甲虫，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无 污染、无残留，本发明球孢白僵菌XNBb-04菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境， 有利于环境保护。
[0045] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据 实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。 CN 105176828 A 说明书 7/7 页
【主权项】
1. 一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，其特征在于球孢白僵菌XNBb-04菌株于2014年3月 6日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2014075。2. 根据权利要求1所述的球孢白僵菌XNBb-04菌株，其特征在于球孢白僵菌XNBb-04 菌株的形态学特征描述如下：菌落初呈白色平绒状，后变乳黄色粉末状，在马铃薯琼脂葡 萄糖培养基培养条件下，菌落背面无色或黄色；分生孢子梗短小，无色，无隔膜，顶端曲折状 延伸，单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明，瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小 为96ym至142ymX4. 9ym至7. 3ym，平均大小为120ymX5. 8ym;分生孢子呈球形、 卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2.47ym至5.21ymX1.95ym至3.63ym，平均大小为 3. 16ymX2. 65ym，无厚垣抱子。3. -种根据权利要求1或2所述的球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法，其特征在于 按以下步骤进行： 第一步，一级菌种扩大培养：将球孢白僵菌XNBb-04菌株接入装有PDA斜面培养基的试 管中，放入培养箱，在温度为24°C至28°C、相对湿度为70%至85%条件下培养，待菌丝长满 斜面并产满孢子后得到一级菌株培养物； 第二步，二级菌种扩大培养：在无菌条件下，将培养好的一级菌株培养物的菌种孢子粉 刮下，用无菌水配制成浓度为5XIO7个孢子/mL的悬液，吸ImL接入盛有50mLPDB培养液 的250mL三角瓶中，使培养液中孢子浓度为IO6个孢子/mL，在温度为24°C至26°C、转速为 160r/min条件下振荡培养48小时，转接入装有200mLPDB培养液的500mL三角瓶中，继续振 荡培养24小时至培养液中长满菌丝球得到二级菌株培养物； 第三步，三级菌种扩大培养：在无菌条件下，将二级菌种培养物的菌种按体积比菌株： 固体培养基为1:15的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20°C至23°C、相对湿度 为70%至85%条件下培养15d，直到固体培养基上全部长满白色菌丝。4. 根据权利要求3所述的球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法，其特征在于第三步中 固体培养基的配制方法为：按重量百分比计，将麦麸68%、米糠30%、黄豆粉1%和奶粉1%混 匀，并加入麦麸、米糠、黄豆粉和奶粉总重量70%的水，搅拌均匀，灭菌即得。
【专利摘要】<b>本发明涉及微生物技术领域，是一种球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法，该球孢白僵菌XNBb-04菌株于2014年3月6日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？M？2014075。本发明提供一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，属半知菌门（</b><b>Deuteromycota</b><b>）</b><b>，丛梗孢</b><b>目（</b><b>Moniliales</b><b>），丛梗孢科（</b><b>Moniliaceae</b><b>），</b><b>白僵菌属（</b><i>Beauveria</i>）<b>。球孢白僵菌XNBb-04菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，能够进一步制备活体生物农药，对苜蓿根瘤象甲虫有较好致病力作用，能够有效杀死苜蓿根瘤象甲虫，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，本发明球孢白僵菌XNBb-04菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境，有利于环境保护。</b>CCTCC M 201407520140306
【IPC分类】C12R1/645, A01P7/04, C12N1/14
【公开号】CN105176828
【申请号】
【发明人】李克梅, 赵莉
【申请人】新疆农业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年7月16日