球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，是一种球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法。
【背景技术】
[0002] 苜蓿是全世界最主要的豆科牧草，素有"牧草之王"之美称，由于适应性强，产草量 高，富含蛋白质等特点，在世界上被广泛栽培种植。除了作为家畜的饲草之外，种植苜蓿还 可以改土肥田，提高后茬作物的产量和品质，同时还具有保持水土，改善生态环境的作用。 新疆是苜蓿种植的故乡，也是我国苜蓿种植的主产区之一，苜蓿生产是新疆畜牧业发展的 重要支柱产业之一。
[0003] 苜蓿根瘤象隶属于鞘翅目（Coleoptera)，象甲科（Curculionidae;weevils)。主 要有驴豆根瘤象（5? iiwa Gy11.)和条纹根瘤象（51 ??Λ? L.)。本属象甲约 15种以上，以幼虫危害豆科牧草的根及根瘤而得名，一年发生一代，以成虫在多年生豆科植 物根部或土表枯枝落叶下越冬，广泛分布于欧洲、北美洲各国种植豆科牧草及作物的地区， 我国已知种植豆科牧草及作物的地区主要分布于新疆、甘肃。苜蓿根瘤象甲成虫危害幼苗， 咬食叶片和生长点，抑制植物生长或引起植株死亡，但危害主要来自幼虫取食根部，危害根 和根瘤。幼虫蛀食根和根瘤，减少氮素在根和土壤中的含量，降低土壤肥力，当根瘤受害28% 至91%时，植物根中含氮量降低9%至36%。此外由于根和根瘤被害造成的伤口使病原微生 物易于入侵，又加重了苜蓿根部病害的发生，导致苜蓿草地严重退化，牧草和种子产量大幅 减低甚至绝收，对苜蓿生产造成严重的经济损失。
[0004] 由于苜蓿根瘤象以幼虫生活在苜蓿根际土壤中，直至羽化为成虫才上到地面危害 地上部叶片，但其主要危害虫态是幼虫。在苜蓿根瘤象的防治上，多采用传统的化学防治方 法除治成虫。大量化学农药的使用不仅对环境和苜蓿草造成污染，有悖绿色奶业发展的初 衷，而且对苜蓿根瘤象幼虫难以奏效。利用白僵菌防治苜蓿根瘤象对控制其种群数量的增 加和减少环境污染意义重大，在生物农药防治方面未发现有用于防治苜蓿根瘤象的球孢白 僵菌菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种球孢白僵菌XNBb-04菌株及其培养方法，克服了上述现有技术 之不足，本发明提供一种可以有效防治苜蓿根瘤象的球孢白僵菌XNBb-04菌株，本发明的 另一目的是提供了一种球孢白僵菌XNBb-04菌株的培养方法。
[0006] 本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种球孢白僵菌XNBb-04菌 株，于2014年3月6日保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014075。
[0007] 下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进： 上述球孢白僵菌XNBb-04菌株的形态学特征描述如下：菌落初呈白色平绒状，后变 乳黄色粉末状，在马铃薯琼脂葡萄糖培养基培养条件下，菌落背面无色或黄色；分生孢 子梗短小，无色，无隔膜，顶端曲折状延伸，单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明，瓶梗基 部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小为96 μm至142 μmX4. 9 μm至7. 3 μm，平均 大小为120 μ mX 5. 8 μ m;分生孢子呈球形、卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2. 47 μ m至 5. 21 μ mX 1. 95 μ m至 3. 63 μ m，平均大小为 3. 16 μ mX 2. 65 μ m，无厚垣抱子。
[0008] 本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种球孢白僵菌XNBb-04菌株 的培养方法，按以下步骤进行： 第一步，一级菌种扩大培养：将球孢白僵菌XNBb-04菌株接入装有PDA斜面培养基的试 管中，放入培养箱，在温度为24°C至28°C、相对湿度为70%至85%条件下培养，待菌丝长满 斜面并产满孢子后得到一级菌株培养物； 第二步，二级菌种扩大培养：在无菌条件下，将培养好的一级菌株培养物的菌种孢子粉 刮下，用无菌水配制成浓度为5X IO7个孢子/mL的悬液，吸ImL接入盛有50mLPDB培养液 的250mL三角瓶中，使培养液中孢子浓度为10 6个孢子/mL，在温度为24°C至26°C、转速为 160r/min条件下振荡培养48小时，转接入装有200mLPDB培养液的500mL三角瓶中，继续振 荡培养24小时至培养液中长满菌丝球得到二级菌株培养物； 第三步，三级菌种扩大培养：在无菌条件下，将二级菌种培养物的菌种按体积比菌株： 固体培养基为1:15的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20 °C至23 °C、相对湿度 为70%至85%条件下培养15d，直到固体培养基上全部长满白色菌丝。
[0009] 下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进： 上述第三步中固体培养基的配制方法为：按重量百分比计，将麦麸68%、米糠30%、黄豆 粉1%和奶粉1%混匀，并加入麦麸、米糠、黄豆粉和奶粉总重量70%的水，搅拌均匀，灭菌即 得。
[0010] 本发明提供一种球孢白僵菌XNBb-04菌株，属半知菌门，丛梗孢目，丛梗孢科，白 僵菌属。球孢白僵菌XNBb-04菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，能够进一步制备活体 生物农药，对苜蓿根瘤象甲虫有较好致病力作用，能够有效杀死苜蓿根瘤象甲虫，具有不同 于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，本发明球孢白僵菌XNBb-04 菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境，有利于环境保护。
【附图说明】
[0011] 附图1为本发明的球孢白僵菌XNBb-04菌株菌丝、分生孢子梗和分生孢子形态。
【具体实施方式】
[0012] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体 的实施方式。除非特别说明，本发明中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方 法和设备；除非特别说明，本发明中采用的培养基和试验条件为本技术领域常规培养基和 实验条件；除非特别说明，本发明中所用试剂均为市购。
[0013] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述： 实施例1，该球孢白僵菌XNBb-04菌株于2014年3月6日保藏于典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCC M 2014075。
[0014] 实施例2,该球孢白僵菌XNBb-04菌株的形态学特征描述如下：菌落初呈白色平 绒状，后变乳黄色粉末状，在马铃薯琼脂葡萄糖培养基培养条件下，菌落背面无色或黄色； 分生孢子梗短小，无色，无隔膜，顶端曲折状延伸，单生或聚集成孢梗束，壁光滑，透明，瓶 梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，大小为96 μ m至142 μ mX 4. 9 μ m至7. 3 μ m，平 均大小为120 μ mX 5. 8 μ m;分生孢子呈球形、卵形、椭圆形，无色，单胞，大小为2. 47 μ m至 5. 21 μ mX 1.95 μ m至3.63 μ m，平均大小为3. 16 μ mX 2.65 μ m，无厚垣孢子。如附图1所 不。
[0015] 具体的，本发明球孢白僵菌XNBb-04菌株的分离获得方法如下： 从新疆维吾尔自治区呼图壁县种牛场苜蓿田中采集的苜蓿根瘤象甲被虫生真菌感染 的僵虫，在新疆维吾尔自治区新疆农业大学"植物病理和微生物重点实验室"分离获得虫生 真菌。
[0016] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA):将200g马铃薯洗净、切块，沸水煮30min后过滤 除渣，加入15g琼脂粉，继续加热融化，再加入20g葡萄糖并加入水使总体积为1000ml，分 装，经高压蒸汽灭菌锅灭菌（121°C，30min)。
[0017] 无菌操作条件：所有器皿和用具须经高压灭菌锅灭菌（12rC，30min)，接种、纯 化、保种均在超净工作台内进行。
[0018] 培养条件：置于26°C光照（14L: 10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜 面，再转入4 °C冰箱贮存。
[0019] 一、球孢白僵菌菌株的分离、纯化、鉴定： S1、分呙 从采回的被虫生真菌感染的苜蓿根瘤象甲虫尸样品上分离病原菌：利用质量浓度为 0. 1%的次氯酸钠溶