一种抗猪圆环病毒合成肽疫苗及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种抗猪圆环病毒合成肽疫苗及其用途。
【背景技术】
[0002] 抗体在抗感染免疫中具有重要的作用。抗体直接和病原体结合，阻止病原体感染 正常细胞；抗体还可以和细菌毒素作用，阻断毒素作用于靶细胞。此外，抗体也可以吸附 于病原体表面，从而激活补体介导的途径来裂解病原体或增进吞噬细胞，如巨噬细胞、嗜中 心粒细胞的吞噬作用以及自然杀伤性细胞介导的ADCC作用。另外，抗体，特别是IgG，还 可以穿过母体胎盘进入胎儿的循环系统，从而保护胎儿在出生初期免受病原体的感染。因 为抗体强大的抗感染作用，不难理解几乎所有上市的人用疫苗保护效力都与抗体水平相关 (Vaccines, 6thedition,S.A.Plotkin)〇
[0003] 抗体能够抗病原侵袭从而对机体起保护作用，如何提高疫苗的免疫原性从而增 强抗体的应答水平成为疫苗研究与开发领域的关键性问题。抗体的分泌细胞称为浆细 胞，其来源于活化的B细胞，特别是位于淋巴组织生发中心的B细胞（Germinal Center B cells，GC B)。GC B细胞分化成浆细胞需要抗原的持续刺激。灭活疫苗或亚单位疫苗中的 佐剂成分很大程度是通过缓释抗原，从而向GC B细胞提供持续抗原刺激，促进其分化成分 泌抗体的浆细胞。除了抗原刺激，GC B细胞还需要激活的、同源性（cognate)的⑶4T细胞 的"帮助"才能分化成浆细胞。激活的CD4T细胞在不同的免疫微环境下分化成功能和表型 不同的亚类，包括THl、TH2以及TH17等，这些激活的⑶4T细胞通常被称为辅助性T细胞 (helper T cell，Th)。其中THl和TH2都具有"帮助" B细胞分化成浆细胞的能力。
[0004] 最新的研究发现，专业提供B细胞"帮助"的辅助性T细胞是一个不同于THl和TH2 的新型亚类。因该亚类在细胞表面高度表达趋化因子受体CXCR5,受趋化因子CXCL13的招 募后，迀移至B细胞滤泡区域而被称为滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cell)。 在滤泡区里，活化的Tfh细胞向GC B细胞提供CD40L、ICOS、IL-21等"帮助"信号，确保GC B细胞的存活并促进其分化为浆细胞。而B细胞欲获得Tfh细胞的"帮助"，必须将Tfh的 TCR可识别的表位肽段置于MHC II上，并展示在细胞表面供TCR结合以激活Tfh细胞。综 上，B细胞分化成分泌抗体的浆细胞，先后需要三个步骤：I)B细胞利用B细胞受体（B cell receptor, BCR)特异性地识别、结合抗原，从而激活BCR信号通路，使B细胞处于活化状态， 为随后的细胞增值和浆细胞分化作准备；2)抗原与BCR结合后，以内吞（Endocytosis)的 方式被吞入B细胞形成内体（Endosomes)，在内体低pH条件下，抗原被降解、截断成 13-25个氨基酸的短肽，这些短肽被置于B细胞的MHC II分子上，并被转运至细胞表面，供 Tfh的TCR识别。3) Tfh的TCR识别B细胞MHC II类分子递呈的抗原后，通过膜上的共刺 激分子CD28与B细胞的B7分子结合而活化，活化的Tfh细胞上调表达CD40L，该分子与B 细胞膜受体CD40结合进一步刺激B细胞，使B细胞完全活化。所以，诱导较高抗体水平的 抗原至少包含两个部分，一个是可供B细胞BCR识别的抗原成分，另外则是可以被TCR识别 的T细胞表位，二者缺一不可。
[0005] 所有有核细胞表面都分布MHCI类分子，而MHCII类分子主要分布于专职抗原 递呈细胞膜，如B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。MHCII类分子以一定的亲和力与抗原肽 结合为复合物（PMHC)并递呈于细胞表面，Tfh细胞利用TCR特异性的识别、结合该复合物 而被激活。威胁人类的病原体种类繁多，并时常变异，因而MHC基因的高度多态性和多基因 性极大扩展了个体对抗原肽递呈的范围，提高个体对不利环境的抵御能力，有利于维持种 群生存与延续。最新研究发现，抗原肽与MHCII类分子的亲和力越高，两者的结合范围越 广，TCR识别、结合pMHC的能力越强，则生成效应性Tfh细胞群就越多，产生的免疫效力更 强。因此，研制一种对MHCII类分子具有普遍亲和力的T细胞表位抗原肽，成为当前疫苗 研制的重大课题。
[0006] 早期的实验已经证明，抗体的生成需要⑶4T细胞的"帮助"。以此为基础，通常把 B细胞表位或其它化学小分子类的半抗原成分共价偶联到载体蛋白，如KLH、BSA、0VA上，这 些载体蛋白在BCR识别和结合抗原后，随目标抗原一起被内吞到B细胞内，从而被加工、展 示于MHCII上，继而递呈给CD4T细胞，使CD4T细胞活化，相应的B细胞在获得活化CD4T 细胞帮助后，分化成浆细胞产生抗体。另外，在疫苗学领域，通常将B细胞表位和CD4T细胞 表位的组合物作为抗原接种机体，使B细胞在CD4T细胞的帮助下产生抗体，从而起到免疫 保护的作用。尽管动物用包含CD4T细胞表位和B细胞表位的口蹄疫合成肽疫苗已经上市， 但此类合成肽疫苗大部分还处于试验阶段，免疫效果还有待商榷。迄今为止，尚未有人用合 成肽疫苗上市，一个重要的原因是对Tfh细胞及B细胞相互关系的认识还处于初级阶段，所 设计的合成肽疫苗刺激能帮助的B细胞的CD4T细胞（即Tfh)的数量和质量有待提高。
【发明内容】
[0007] 本发明的一方面提供了一种多肽，其包含T1-B-T2或T2-B-T1构型排列的氨基酸 序列，
[0008] 其中，Tl为修饰后的SEQIDNO:1;
[0009] B为SEQIDNO:5;
[0010] T2 为修饰后的SEQIDNO:2。
[0011] TUB或T2可以通过间隔序列来功能性连接，其中间隔序列可以是任何不影响T1、 B或T2结构或者功能的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，间隔序列为eK。
[0012] 在本发明的实施例中，所述修饰包括置换、添加和/或缺失原来的细胞表位中的 一个或多个氨基酸，且修饰后的细胞表位与所述原来的细胞表位具有相同免疫功能。
[0013] 在本发明的代表实施例中，所述SEQIDNO: 1的修饰可以包括下列的一个或多个 修饰：
[0014] (1)第1位氨基酸丝氨酸置换为疏水性氨基酸；
[0015] (2)第2位氨基酸谷氨酸置换为带正电的氨基酸；
[0016] (3)第12位氨基酸谷氨酸置换为疏水性氨基酸；和
[0017] (4)第13位氨基酸甘氨酸置换为疏水性氨基酸。
[0018] 在本发明的代表实施例中，所述SEQIDNO:2的修饰包括下列的一个或多个修 饰：
[0019] (1)第1位氨基酸脯氨酸置换为疏水性氨基酸；
[0020] (2)第3位氨基酸酪氨酸置换为其他芳香族氨基酸；
[0021] (3)第6位氨基酸谷氨酰胺置换为疏水性氨基酸；
[0022] (4)第7位氨基酸天冬酰胺置换为带正电或芳香族的氨基酸；和
[0023] (5)第13位氨基酸苏氨酸置换为疏水性氨基酸。
[0024] 在本发明的一个具体实施例中，Tl表位包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
[0025] 在本发明的一个具体实施例中，T2表位包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
[0026] 其中，上述表位组合通过人工合成、通过原核或真核细胞表达、或通过基因重组技 术嵌入病原体而获得。
[0027] 在本发明的另一个方面中，提供了 一种分离的多核苷酸，其包含选自下组中的一 种：
[0028] a)编码如前面所述的多肽；或者
[0029] b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。
[0030] 在本发明的另外一个方面中，提供了一种疫苗，其包含至少一种前面所述的多肽。
[0031] 在本发明中，本发明的疫苗还包含医学或兽医学上可接受的递送载体或佐剂。
[0032] 在本发明的实施例中，疫苗施用途径选自眼内、鼻内、肌内、注射、口服、腹腔内、皮 下、局部、皮内和透皮递送。
[0033] 在本发明的一个方面中，提供了一种疫苗佐剂，其包含至少一种前面所述的多肽。
[0034] 此外，本发明的多肽在制备用于抗猪圆环病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用 途。以及根据本发明的分离的多肽用于生产多核苷酸的用途也是在本发明的范畴内。
[0035] 在本发明中，本发明的多肽在制备单克隆或多克隆抗体中的用途。
[0036] 在本发明中，本发明的多核苷酸在制备多肽中的用途。
[0037] 在本发明中，本发明的疫苗在制备用于抗猪圆环病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗 中的用途。
[0038] 在本发明中，本发明的疫苗佐剂在制备用于抗猪圆环病毒的预防性疫苗、治疗性 疫苗中的用途。
[0039] 本发明的有益效果
[0040] 通过实施例，发明人发现T1-B-T2诱导机体产生抗体的能力比单一的Tl-B或T2-B 或B高5-10倍，此发现说明本发明的序列组合可以刺激机体产生较强的Tfh应答，更重要 的是，增强Tfh的应答能力可以大幅度地促进相应的抗体产生。本发明所述的包含表位组 合产物可以广泛地使用于抗病原感染或肿瘤或自身免疫性疾病的预防性疫苗、治疗性疫 苗，以诱导产生高水平的抗体；本序列组合也可用于生产多克隆或单克隆抗体，用于诊断、 治疗以及科研。因为本发明为人工合成产物，具有成分明确、质量可控、靶标清楚的特点，用 于合成肽疫苗具有较强的优势。
[0041] 下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中，本发明的上