[0029] (1)将实施例1提取的1~6层家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂（各5 y g)经非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶置于质量分数为0.07%的蛋白酶K溶液（IOOmM Tris-HCl， pH7. 5)中，37°C、60rpm摇床条件下避光振荡孵育20min ;
[0030] (2)除去蛋白酶K溶液，用MilliQ水清洗蛋白胶两次，室温静置15min ;
[0031] (3)加入质量分数为0. 1 %邻联茴香胺染色液（pH7. 5, IOOmM Tris-HCl缓冲液溶 解）和0? 2% N-乙酰-D, L-苯丙氨酸-P -aphthylester基质（由N，N'_二甲基甲酰胺溶 解）的混合液染色，37°C、60rpm摇床条件下避光振荡孵育20min;
[0032] (4)倒掉基质和染色液，加入MilliQ水清洗胶面，终止反应，被蛋白酶分解的基质 能够将凝胶染成红色，而蛋白酶抑制剂所在的位置因蛋白酶的活性被抑制而不会被染上颜 色。因此，蛋白酶抑制剂所在位置为白色条带，结果如图1所示。
[0033] 结果发现，从内茧层提取的蛋白酶抑制剂对真菌蛋白酶K的抑制活性较弱，从外 茧层中提取的蛋白酶抑制剂对真菌蛋白酶K的抑制活性最强。
[0034] 实施例3、测定家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂对球孢白僵菌孢子萌发的抑制活性
[0035] 家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂对球孢白僵菌孢子萌发的抑制活性测定，具体方法 如下：
[0036] (1)将球孢白僵菌接种于PDA固体培养基上，26°C恒温培养箱培养14天；
[0037] (2)加入高压灭菌后的质量分数为0? 05%的Tween-80,刮取孢子，涡旋，使孢子悬 浮，使用灭菌棉花过滤孢子悬液两次，以除去菌丝；
[0038] (3)流出液在4°C、6000g条件下离心10min，弃上清，加入MilliQ水清洗孢子， 4°C、6000g条件下离心弃上清；
[0039] (4)将孢子保存于灭菌后Mi 11 iQ水中，血球计数板计数后，置于4°C保存备用。
[0040] (5)取100 y L PDB培养基，加入白僵菌孢子和实施例1提取的家蚕蚕茧抗真菌蛋 白酶抑制剂（65 y g)，在26°C，80rpm摇床中进行孵育，一段时间之后观察白僵菌孢子的萌 发情况，用血球计数板计算孢子萌发率，结果如图2所示。
[0041] 结果发现，从内茧层提取的蛋白酶抑制剂对球孢白僵菌孢子萌发的抑制活性较 弱，从外茧层中提取的蛋白酶抑制剂对球孢白僵菌孢子萌发的抑制活性最强。
[0042] 实施例4、测定家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的热稳定性
[0043]家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的热稳定性测定，具体步骤如下：
[0044] (1)将从不同茧层提取的蛋白酶抑制剂进行沸水浴lOmin，冰上冷却后，4°C、 12000rpm离心10min，收集上清。用Thermo Scientific Q Exactive质谱仪对从热处理后 最外层蚕茧中提取出的蛋白质进行质谱鉴定，发现所提取的主要成分是27种蛋白酶抑制 剂，占总蛋白含量的93%。结果表明，经热处理后蛋白酶抑制剂的成分改变很小。
[0045] 然后利用实施例2中的方法测定热处理后的家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂对蛋白酶K的 抑制活性，结果如图3所示。结果显示，热处理后家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂对蛋白酶K仍有抑 制活性。
[0046] 再利用实施例3中的方法测定热处理后的家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂对球孢白僵菌 孢子萌发的抑制活性，结果如图4所示。结果显示，热处理后家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂对球孢 白僵菌孢子仍有抑制活性。
[0047] 上述结果表明家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂的热稳定性好。
[0048] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂主要为丝氨 酸蛋白酶抑制蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂为如SEQ IDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQID NO. 7、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9、SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11、SEQIDNO. 12、SEQID NO. 13、SEQIDNO. 14、SEQIDNO. 15、SEQIDNO. 16、SEQIDNO. 17、SEQIDNO. 18、SEQID NO. 19、SEQIDNO. 20、SEQIDNO. 21、SEQIDNO. 22、SEQIDNO. 23、SEQIDNO. 24、SEQID NO. 25、SEQIDNO. 26、SEQIDNO. 27、SEQIDNO. 28 和SEQIDNO. 29 中的一种或多种的混 合物。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述真菌为球孢白僵菌。5. 家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将蚕茧分 层、剪碎，然后加入PH7. 5、50~OOmM的Tris-HCl缓冲液，在18 °C~37 °C、转速110~ 220rpm条件下提取15~30min;然后在18°C~25°C，转速为10000~14000rpm下离心 10~15min，取上清液，用0. 22ym滤膜过滤后，收集滤液得家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂。6. 利用权利要求5所述分离方法制备的家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂。
【专利摘要】本发明公开了家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在抗真菌中的应用及其分离方法，分离方法如下：将蚕茧分层、剪碎，然后加入pH7.5、100mM的Tris-HCl缓冲液，在37℃、转速220rpm条件下提取30min；然后在室温，转速为10000rpm下离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后，得家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂；获得的蛋白酶抑制剂能够抑制林伯氏白色念球菌分泌的真菌蛋白酶K的活性，抑制家蚕致病性真菌球孢白僵菌的孢子萌发，并且在沸水中孵育10min后仍保持活性；属于天然的、高活性、高稳定性的抗真菌蛋白质，无毒无害；同时，本发明利用的蚕丝资源丰富，为蚕丝的多元化开发利用提供了新途径。
【IPC分类】C07K1/34, A61P31/10, A61K38/57, C07K14/81
【公开号】CN105175534
【申请号】
【发明人】赵萍, 董照明, 郭晓朦, 张艳, 夏庆友
【申请人】西南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月23日