家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在抗真菌中的应用及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌 的药物中的应用，还涉及分离家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的方法和由该方法获得的产 品。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上蚕丝生产的第一大国，每年的蚕茧产量几十万吨，丝绸工业产值上 百亿元，丝绸产品占世界总量的70%以上。然而由于国内丝织业技术和工艺落后的影响，我 国的蚕丝产业技术含量低、附加值低。因此，对蚕丝进行深入的研究、深入挖掘蚕丝资源的 新用途，对于开拓蚕丝的应用领域、提高蚕丝的应用价值具有重要的意义。可喜的是，近年 来人们认识到了蚕丝作为一种天然蛋白质宝库的价值。除了在家居和服饰领域，蚕丝在保 健品、化妆品、食品、和生物医学材料等领域也成为了研究和应用的热点。
[0003] 蚕丝的主要组份是丝素和丝胶蛋白。丝素蛋白是一种纤维蛋白，是丝的核心成分， 约占丝重的70~80%。丝胶是一种胶状的球蛋白，存在于丝素的外围，包被着丝素，对丝 素起着保护和胶粘作用。丝素蛋白构成了蚕茧的骨架，而丝胶蛋白作为黏附的胶水，从而构 建起了用于保护蚕体的蚕茧。蚕丝蛋白被认为具有抗菌、抗氧化和促进细胞增殖等特性，表 明了蚕丝中可能还存在其他有生物学活性的蛋白质，但是关于它们的成分与特性还未见报 道。蚕丝中活性蛋白的研究和应用对蚕丝的个性化、功能化和多元化利用具有重要意义，将 显著提升蚕丝在多个行业领域的开发利用价值。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的 药物中的应用，本发明的目的之二在于提供家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法；本 发明的目的之三在于提供由上述方法分离获得的家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用。
[0007] 优选的，所述家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。
[0008] 更优选的，所述家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂为如下SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQID NO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5、SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9、 SEQIDNO.IO^SEQIDNO. IUSEQIDNO. 12^SEQIDNO. 13^SEQIDNO. 14^SEQIDNO. 15^ SEQIDNO. 16、SEQIDNO. 17、SEQIDNO. 18、SEQIDNO. 19、SEQIDNO. 20、SEQIDNO. 21、 SEQIDNO. 22、SEQIDNO. 23、SEQIDNO. 24、SEQIDNO. 25、SEQIDNO. 26、SEQIDNO. 27、 SEQIDNO. 28和SEQIDNO. 29所示，具体如表I所示。
[0009] 最优选的，所述真菌为球孢白僵菌。
[0010] 2、家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法，包括如下步骤：将蚕茧分层、剪碎， 然后加入pH7. 5、50~IOOmM的Tris-HCl缓冲液，在18°C~37°C、在转速110~220rpm条 件下提取15~30min ;然后在18°C~25°C，转速为10000~14000rpm下离心10~15min， 取上清液，用0. 22 y m滤膜过滤后，收集滤液得家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂。
[0011] 本发明中，如果提取温度过高，提取时间过长，则得到的杂蛋白会变多，而抗真菌 蛋白酶抑制剂的相对比例会变低。提取中将蚕茧分层的作用是得到不同品质的抗真菌蛋白 酶抑制剂，其中从蚕茧外层提取的抗真菌蛋白酶抑制剂的种类和含量会相对较多，而从蚕 茧内层提取的抗真菌蛋白酶抑制剂的种类和含量会相对较少。
[0012] 3、利用所述分离方法制备的家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂。
[0013] 本发明的有益效果在于：本发明首次发现了家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂具有抗真菌的 活性，并且抗真菌蛋白酶的活性高，能够明显地抑制白色念球菌分泌的蛋白酶K的活性，还 能抑制家蚕致病性真菌球孢白僵菌的孢子萌发；此外本发明分离的家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂 稳定性高，在沸水中孵育IOmin后仍然保持活性；并且本发明家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制 剂属于天然真菌蛋白酶抑制剂，对人、畜无毒害；还具有生产成本低的优点，本发明家蚕蚕 茧抗真菌蛋白酶抑制剂利用了家蚕蚕茧这种丰富的动物纤维资源，为蚕丝的多元化利用提 供了新的途径。
【附图说明】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0015] 图1为蚕茧各茧层中真菌蛋白酶K抑制剂的活性染色。
[0016] 图2为与蚕茧各茧层中真菌蛋白酶抑制剂孵育后，球孢白僵菌孢子萌发率的变 化。
[0017] 图3为煮沸处理的各茧层中真菌蛋白酶K抑制剂的活性染色。
[0018] 图4为煮沸处理的各茧层中真菌蛋白酶抑制剂孵育后，球孢白僵菌孢子萌发率的 变化。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0020] 实施例1、家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法
[0021] 将蚕茧分为6层，然后分别剪成细小的碎片，紫外灭菌过夜，加入适量的IOOmM Tris-HCl (pH7. 5)缓冲液，置于37°C下，在转速220rpm的摇床中提取30min ;然后在室温 (18~25°C )，转速为1000 Orpm下离心15min，取上清液，使用0. 22 y m滤膜过滤后，在-20°C 保存。
[0022] 用BCA法，以牛血清白蛋白为标准，测定所提取到的蛋白在595nm处的吸光度，然 后根据标准曲线计算，测得茧层1 (最内层）到茧层6 (最外层）的样品浓度为0. 79、1. 13、 I. 09、0. 90、0. 83 和 0? 97mg/mL。
[0023] 再利用Thermo ScientificQExactive质谱仪对从最外层蚕苗中提取出的蛋白 质进行质谱鉴定，发现所提取的主要成分是29种蛋白酶抑制剂，占总蛋白含量的89%。将 从最外层蚕茧中提取出的蛋白质进行煮沸处理后再进行质谱鉴定，结果显示煮沸处理的家 蚕蚕茧蛋白酶抑制剂主要成分是27种蛋白酶抑制剂，占总蛋白含量的93%。鉴定结果如表 1所示：
[0024] 表1、家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂
[0025]
[0027] 实施例2、测定家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的真菌蛋白酶K的抑制活性
[0028] 家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂对真菌蛋白酶K的抑制活性测定，具体步骤如下：