电子有限公司），3K30高速低温离心机（sigma 公司），HoferMiniVE型western电泳印记系统（美国Amersham公司），SYC-2101水平摇床 (南京畅翔仪器设备有限责任公司），高速台式离心机（珠海黑马医学仪器有限公司），微 型电泳及电转移系统（美国BIO-RAD公司），三气细胞培养箱1750型（法国Jouan公司）， M0DEL5410纯水器Milli-Q plus型（法国Millipore公司），隔水式电热恒温培养箱（上 海跃进医疗器械厂），SHff-I型恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂），YG-875B超净工作台 (苏州医疗设备厂），连续波长酶标仪（Benchnlark Plus TM，Bio-RAD公司），倒置显微镜 (日本Nicon公司），全自动灭菌锅（日本sanyo公司），台式低温高速离心机（Bechman公 司），电泳仪（P〇werPAL3000, Bio-RAD公司），DU640型紫外分光光度计（美国Beeklllan 公司）。
[0029] 二、试验方法
[0030] 1、细胞培养
[0031] 人神经胶质瘤U251细胞以常规方法复苏后使用DMEM培养基（含10% FBS)培养。 细胞以60_的培养皿培养，加入3mL DMEM完全培养基。细胞长至80 %融合时，以HankS平 衡盐溶液（HBSS)冲洗两遍，改以不含血清的DMEM培养至药物处理前。
[0032] 2、化合物（I )的处理
[0033] 化合物（I )先以DMSO 0? ImL溶解后均匀分散于DMEM不完全培养基中。最终处 理细胞的化合物（I )浓度为100,500,1500 ymol/L，处理Ih后继续予以缺氧培养。
[0034] 3、化合物（I )体外抑制细胞增殖实验
[0035] 文献报道化合物（I )在50ymol/L浓度范围内，对SMMC7721细胞既无显著的 生长抑制，也不显著增加流式细胞仪检测中的凋亡率。本研究选择0-200 ymol/L浓度的 化合物（I )进行实验。在96孔板中分别加入不同浓度化合物（I )100y L，使药物终 浓度为 5 y mol/L、10 y mol/L、25 y mol/L、50 y mol/L、100 y mol/L、200 y mol/L，每浓度设 6 个复孔，阳性药对照组加入5-氟尿啼啶（5-Fluorouracil，5-FU) 10 y g/mL，对照孔加入等 体积DMEM培养液。细胞株常规培养后取指数生长期细胞用完全DMEM培养基调整至（1~ 2) X IO5个/mL，每孔接种细胞悬液100 y L。培养48h后，以MTT法检测细胞增殖程度，每孔 加入2. 5mg/mL MTT 20yL，继续培养4h，离心后小心弃去培养液，每孔加入150yL DMS0,在 震荡器上震荡IOmin后于酶标仪中以570nm波长检测，测定各孔的光密度值（OD)，抑制率按 下列公式计算：抑制率（％) = (1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值）X 100%。
[0036] 4、化合物（I )体内抑制裸小鼠U251移植性肉瘤生长实验
[0037] 体外培养的U251细胞扩大培养后，选择生长最佳状态的细胞培养体系，离心， 用生理盐水按体积比1:3 (肿瘤细胞：生理盐水）稀释混匀。用ImL-次性注射器吸取 上述细胞悬液〇. 15mL，穿过小鼠右后肢大腿肌肉接种于腹股沟皮下，然后随机分为空白 组（Untreated，等容积NS)、溶剂对照组（vehide，等容积NS+DMS0)、化合物（I ) 1. 0， 2. Ommol/kg腹腔注射组，每组6只，按0? lmL/lOg体重给药，环磷酞胺（Cyelophosphamide， CTX)阳性对照组为0.02g/kg体重腹腔注射给药。一天一次，连续给药IOd后处死小鼠，分 离肿瘤称重。抑瘤率（％) = (1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重）X 100%。
[0038] 5、统计分析
[0039] 采用SPSS13. 0统计分析软件，数据以s表示，经one-wayANOVA(多重比较用 LSD法）、independent samples t-test进行统计学检验，具体见各数据表格和图表，以 P < 0. 05定为差异有统计学意义。
[0040] 三、结果及结论
[0041] 1、化合物（I)单药处理对U251细胞增殖的影响
[0042] 用MTT检测法检测各孔在570nm下的吸光度值（optieal density，0D57。），以此反 映U251细胞增殖的活性。各组OD57。值经方差齐性检验，P = 0. 460,说明方差齐性；经单 向方差分析，F = 57. 577, P = 0. 121，说明组间差异没有统计学意义。提示化合物（I ) 体外在< 200 y mol/L给药浓度下对U251细胞的增殖没有抑制作用。结果见表1 (one-way AN0VA:P = 0. 121 ^ 0. 05) 〇
[0043] 2、化合物（I)单药处理对荷瘤小鼠的抑瘤作用
[0044] 各组瘤重值经方差齐性检验，F = 1. 903, P = 0. 141，说明方差齐性；经单向方 差分析，F = 17. 931，P = 0. 000,说明组间差异有统计学意义，需要进一步采用LSD检验 方法行多重比较。化合物（I )剂量为l.〇,2. Ommol/kg腹腔注射组的处理组与溶剂对 照组（Vehiele)比较，P值分别为：0.000,0. 000,说明差异有统计学意义，提示通过腹腔 注射给药，化合物（I )对荷U251作用，抑瘤作用有随剂量增加而增强趋势。见表2 (LSD test:*P<0.05vs Vehicle group)。
[0045] 结论，化合物（I)单药处理对U251细胞增殖作用的实验结果表明，化合物（I) 体外对U251细胞的增殖没有抑制作用，说明在一定剂量范围内的化合物（I)处理对肿瘤 细胞的生长没有明显的影响，提示化合物（I)对U251细胞没有直接的细胞毒或诱导细胞 凋亡作用。而在化合物（I)对荷U251实体瘤裸小鼠的抑瘤作用实验中，发现化合物（I) 剂量为1. 0, 2.Ommol/kg时，对荷U251实体瘤裸小鼠表现出一定的抑瘤作用，且抑瘤作用随 剂量增加而增强。结合上述实验结果，说明化合物（I)具有一定的抗U251肿瘤作用，其 作用是通过细胞毒或者诱导凋亡以外的某种机制来实现的。
[0046] 表1化合物（I )对U251人神经胶质瘤细胞体外增殖的作用（n = 6, ？±s )
[0047]
[0048] 表2化合物（I )腹腔注射给药对荷U251实体瘤裸小鼠的抑瘤作用（n = 6, $±s )
[0049]
[0050] 实施例3
[0051] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0052] 实施例4
[0053] 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0054] 实施例5
[0055] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0056] 实施例6
[0057] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0058] 实施例7
[0059] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌 熔封得粉针剂。
[0060] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I )，O2. 权利要求1所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 千金子的干燥成熟种子粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱 体积，再用75 %乙醇洗脱12个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物 浸膏；（c)步骤（b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、 30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正 相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I )。3. 根据权利要求2所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，用80% 乙醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的 化合物（I )和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I )在制备治疗人神经胶质瘤的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗人神经胶质瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的克罗烷型二萜化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的克罗烷型二萜化合物，可以从千金子的干燥成熟种子中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物具有抗U251肿瘤作用，且抑瘤作用随剂量增加而增强。化合物(Ⅰ)在治疗人神经胶质瘤方面具有潜在的应用价值，可以用来开发成治疗人神经胶质瘤的药物。
【IPC分类】A61P35/00, C07D493/20, A61K31/366
【公开号】CN105175428
【申请号】
【发明人】章丽珍
【申请人】章丽珍
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月26日