一种γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料及其制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物载体材料技术领域，具体涉及一种γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料及其制备方法。
【背景技术】
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[0002]组织修复是一个复杂的过程，涉及多能干细胞分化增殖、细胞外基质与信号分子的识别、相关因子的表达及靶向作用和新骨的发育成熟等一系列链式(Cascade)过程。其中各种成骨因子如骨形态发生蛋白家族(BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子β (TGF-β)、血小板源性生长因子(TOGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等，都在这一过程中起着重要的调控作用。引入生长因子是提高骨缺损部位生长因子的浓度，提高骨组织的形成速度的重要手段。将各种成骨因子施加于骨缺损区域以刺激成骨，已被证明有显著的效果。但是，一种理想的载体系统应该是具有高效、仿生、微创且能自身充当支架等多方面优点的。
【发明内容】
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[0003]针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料及其制备方法。本发明以γ-聚谷氨酸(γ-PGA)生物高分子和纳米羟基磷灰石(Nano-HAp)纳米颗粒为基质，构建一种γ _聚谷氨酸/轻基磷灰石(γ-PGA/HAp)凝胶微球载体材料。
[0004]本发明所提供的以γ -聚谷氨酸生物高分子和羟基磷灰石纳米颗粒为基质的凝胶微球载体材料，是将γ -聚谷氨酸与修饰剂(硅烷偶联剂)置于醇溶液中，在40?80°C条件下，使硅烷偶联剂与γ -聚谷氨酸表面的羧基发生反应，使硅烷偶联剂修饰至纳米颗粒表面，同时与纳米羟基磷灰石相结合，使得羟基磷灰石表面同时具有亲水疏水基团，从而得到具有亲水/疏水两亲性的γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料。该凝胶微球载体材料具有较大的承载率、有效成分隔离作用和具有指定释放能力等特点，将药物或生长因子溶于凝胶微球载体材料中，就可以便利地将此种载体材料作为药物或生长因子的高效载体进行实际应用。
[0005]本发明的γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料，其特征在于，是通过以下步骤制备的:
[0006](I)制备硅烷偶联剂处理液:将水和醇按体积比1:7?10混合均匀形成醇溶液，然后按每10mL醇溶液加入0.1?0.5mL聚缩水甘油醚的量在醇溶液中加入聚缩水甘油醚预混，再加入冰醋酸调节PH值为3.0?5.0，然后加入硅烷偶联剂，溶解后即得到硅烷偶联剂处理液，所述的硅烷偶联剂的用量是按照硅烷偶联剂:醇溶液的体积比为1:4?6的比例添加；
[0007](2)制备γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末:将γ -聚谷氨酸氢盐粉末超声溶解在无水二甲基亚砜溶液，制备成5?20g/L的γ -聚谷氨酸I溶液，按γ -聚谷氨酸I溶液:硅烷偶联剂处理液体积比为1:0.5?2的比例将γ-聚谷氨酸I溶液加入到步骤(I)的硅烷偶联剂处理液中，超声分散，得到γ-聚谷氨酸I溶液和硅烷偶联剂处理液的混合液，每10ml混合液加入1.0?5.0g轻基磷灰石纳米颗粒，并置于40?80°C的水浴中搅拌偶联，反应2?6h，室温静置，再以溶液总体积的2?4倍体积的丙酮沉淀产物，再经离心取沉淀，用去离子水洗涤，将洗涤后的产物收集、冷冻干燥，即得γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末；
[0008](3)称取步骤(2)的γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末I?5g，并将其加入到1.0?5.0g/L50?200ml的γ -聚谷氨酸钠盐溶液II中混合均匀后，超声分散，再滴加聚缩水甘油醚，其与γ -聚谷氨酸钠盐的质量之比为1:2.5?10，均速搅拌，并升温至37?80°C，使其发生凝胶转变，即可得γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料，所述的γ -聚谷氨酸钠盐溶液II是通过将γ -聚谷氨酸钠盐粉末溶解在去离子水中所得。
[0009]步骤(I)所述的娃烧偶联剂，优选为氣基娃烧偶联剂、环氧基娃烧偶联剂、脈基娃烷偶联剂或异氰酸酯硅烷偶联剂。
[0010]步骤⑴所述的醇为乙醇、甲醇或异丙醇。
[0011]所述的聚缩水甘油醚，优选为烯丙基缩水甘油醚、甘油三缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚或聚环氧乙烷山梨醇聚缩水甘油醚及其混合物。
[0012]步骤(2)所述的γ -聚谷氨酸氢盐，其制备方法优选为:将γ -聚谷氨酸钠盐粉末加入到三角瓶中，以4倍(v/w)的去离子水搅拌溶解，然后加入0.8倍(v/w)37%的盐酸，配成当量浓度为2N的盐酸水溶液，持续室温搅拌直到有产物沉淀时再继续搅拌反应6小时至反应完全，最后利用过滤法收集沉淀产物，并用3?4倍(v/v)的去离子水冲洗数次，冷冻干燥后得到γ -聚谷氨酸氢盐。
[0013]步骤⑵所述的羟基磷灰石纳米颗粒，其含量彡97%，纳米尺经〈lOOnm。
[0014]步骤(3)中的γ-聚谷氨酸钠盐是按照专利公开号为:CN1932007A，发明名称为:γ-聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法制备获得。
[0015]将药物或生长因子装载入本发明的γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料中的方法为:将药物溶于PBS磷酸盐缓冲液中，制成浓度为0.01?50g/L的水相溶液；在O?4°C的环境中，将Igy-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶载体样品浸泡于50mL药物的水相溶液中，将其放入真空干燥箱内，保持真空度0.05MPa，使药物溶液在压力作用下扩散进入羟基磷灰石微球内部，10?30min后取出，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球，经冷冻干燥得到载有药物的γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球。
[0016]本发明的γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料直径为2?5 μ m，药物或生长因子在γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料中的平均装载量高达34ug/g。
[0017]与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下:
[0018](I)本发明的γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料的制备方法简单，所制得的材料透明乳白色，微观下是凝胶中包裹着微球颗粒，所需要的反应试剂种类及用量都较少，成本相对较低，在作为一种生物材料载体的应用中，具有较大承载量、有效成分隔离和具有可控释放能力的效果；
[0019](2)本发明以γ-聚谷氨酸和羟基磷灰石纳米颗粒为基材，合成一种γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石(γ -PGA/HAp)凝胶微球载体材料，将γ -PGA/HAp凝胶微球载体材料包裹药物、生长因子等，由于γ-PGA/HAp的生物可降解特性，能将药物或生长因子平缓地释放出来，并且药物或生长因子的释放速度、出现间隔和维持时间等都可通过调节材料的微结构来加以控制。
【具体实施方式】
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[0020]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0021]实施例1:
[0022]—种γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料，其制备步骤如下:
[0023](I)制备硅烷偶联剂处理液:将水和醇混合均匀形成醇溶液，该醇溶液中水:乙醇的体积比为1:7，然后在10mL醇溶液中加入0.5mL烯丙基缩水甘油醚预混，再缓慢滴加冰醋酸，调节PH值为3.0?4.0，然后加入氨基硅烷偶联剂(KH-570)，室温下水解30min，即得硅烷偶联剂处理液，所述的硅烷偶联剂的用量是按照硅烷偶联剂:醇溶液的体积比为1:4的比例添加，硅烷偶联剂处理液现配现用，一小时之内用完；
[0024](2)制备γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末:秤量2.0g γ -聚谷氨酸氢盐粉末，超声溶解在50mL无水二甲基亚砜溶液，制备成20g/L的γ -聚谷氨酸I溶液，将50mL的γ-聚谷氨酸I溶液加入到10mL上述步骤(I)的硅烷偶联剂处理液中，超声分散20min，得到γ -聚谷氨酸I溶液和硅烷偶联剂处理液的混合液；然后每10ml混合液加入Ig羟基磷灰石纳米颗粒(其含量多97%,纳米尺经〈lOOnm)，并置于40°C的水浴中搅拌偶联，反应2h，室温静置2h ;以4倍体积的丙酮沉淀产物，再经离心取沉淀，再经过去离子水洗涤，将洗涤后的产物收集、冷冻干燥，即得γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末；所述的γ -聚谷氨酸氢盐，其制备方法为:将γ-聚谷氨酸钠盐粉末加入到三角瓶中，以4倍(v/w)的去离子水搅拌溶解，然后加入0.8倍(v/w) 37%的盐酸，配成当量浓度为2N的盐酸水溶液，持续室温搅拌直到有产物沉淀时再继续搅拌反应6小时至反应完全，最后利用过滤法收集沉淀产物，并用3?4倍(v/v)的去离子水冲洗数次，冷冻干燥后得到γ -聚谷氨酸氢盐；
[0025](3)将1.0g的上述步骤(2)中的γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末加入到
1.0g/L 50mL γ -聚谷氨酸溶液II中混合均匀后，逐滴加入烯丙基缩水甘油醚，其与γ _聚谷氨酸钠盐的质量之比为1:2.5，均速搅拌，并升温至37°C，使其发生凝胶转变，即可得γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶载体材料，所述的γ-聚谷氨酸钠盐溶液II是通过将γ-聚谷氨酸钠盐粉末溶解在去离子水中所得。
[0026]将骨形态发生蛋白家族(ΒΜΡ-2)溶于PBS磷酸盐缓冲液中，制成浓度为5.0g/L的水相溶液；在O?4°C的环境中，将Ig γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料样品浸泡于50mLBMPs的水相溶液中，将其放入真空干燥箱内，保持真空度0.05MPa，使BMPs溶液在压力作用下扩散进入γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球内部，30min后取出，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球，经冷冻干燥得到载有BMPs的γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料。γ-聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料的直径为4.7um±0.08um，BMPs在γ -聚谷氨酸/轻基磷灰石凝胶微球中的平均装载量为17ug/g°
[0027]实施例2:
[0028]—种γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石凝胶微球载体材料，其制备步骤如下:
[0029](I)制备硅烷偶联剂处理液:将水和醇混合均匀形成醇溶液，该醇溶液中水:甲醇的体积比为1: 10，然后在10mL醇溶液中加入0.15mL甘油三缩水甘油醚预混，再缓慢滴加冰醋酸，调节pH值为3.0?4.5，然后加入氨基硅烷偶联剂(KH-560)，室温下水解30min，即得硅烷偶联剂处理液，所述的硅烷偶联剂的用量是按照硅烷偶联剂:醇溶液的体积比为1:5的比例添加，硅烷偶联剂处理液现配现用，一小时之内用完；
[0030](2)制备γ -聚谷氨酸/羟基磷灰石微球粉末:秤量1.0g γ -聚谷氨酸氢盐粉末，超声溶解在10mL无水二甲基亚砜溶液，制备成20g/L的γ -聚谷氨酸I溶液，将10mL的γ-聚谷氨酸I溶液加入到10mL