Og离屯、的15秒，弃去流出液体；
[005引 9)重复步骤7、8;
[0056] 10)用移液枪吸750ulRNA洗涂缓冲液I直接加到自旋柱上洗涂柱子。如上方法 离屯、并弃去2ml收集管；
[0057] 11)把柱子装到提供的一干净的新2ml收集试管上，加入500 用乙醇稀释的 RNA洗涂缓冲液II，离屯、，弃去流出液，重复使用该收集试管；
[0058] 12)加入 400Ji1Washsolution, 14000g离屯、2min;
[0059] 13)再用500yI的RNA洗涂缓冲液II洗涂柱子，离屯、并弃去流出液。然后用一个 空的收集试管，极速离屯、空柱子IminW甩干Mu-化柱基质；
[0060] 14)洗脱RNA。把柱子转移到一干淨的1. 5ml离屯、管（试剂盒无提供）并用50~ 100y1的DEPC-水（由试剂盒提供）洗脱RNA。确保加入的DEPC-水是直接加在柱基质上， 极速离屯、Imin;
[0061] I巧加入 100yIEnzymeIncubationBuffer和 15yIDNaseI，14000g离屯、 Imin;
[006引 16)将收集管中的溶液重新移入柱，室温放置15min;
[006引17)将收集到的RNA保存在-70t冰箱中，待用。
[0064] 3、RNA样品的质量分析（Nano化oplOOO分光光度计）
[0065] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280 为 1. 8-2. 2。
[0066] 将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，AgilentTechnologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为 28S: 18S> 2可W初步判定总RNA质量较好。
[0067] 4、miRNA的提取和标记
[006引 1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明 书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照化omson的方法。miRNA标记方法大致如下：1. 4Jig miRNA和500ng5' -憐酸盐-胞喀晚-尿喀晚巧3-3'值harmacon，Chicago,USA)及2单 位T4RNAIigase(肥B，Ipswich，USA)，于4°C解育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应 阴性对照。
[0069] 。标记的RNA用0. 3M醋酸钢和2. 5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15y1 含3XSSC、0.2 %SDS和15%甲酯胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用 LifterSlipTM巧rie，PAUSA)W保证杂交液在忍片和盖片之间均匀流动。
[0070] 3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上（CapitalBioCo巧，Beijing,Qiina)于 42 °C水浴过夜，用洗液洗两遍。
[0071] 5、miRNA忍片操作：
[0072]miRNA忍片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱忍片（单通道忍片），按照说 明书的指示进行miRNA表达谱的检测。
[0073] 6、结果：
[0074] 分析miRNA忍片表达谱的检测结果，可知miRNA-548a-化在急性髓系白血病患者 血液和健康人的血液中的表达存在显著差异，与健康人的血液相比，在急性髓系白血病血 液中miRNA-548a-化的水平显著升高。
[00巧]实施例2QPCR验证差异表达的miRNA-548a-化
[0076] 1、根据miRNA忍片的检测结果选择miRNA-548a-化进行大样本QPCR验证。按照 实施例1中的样本收集方式选择急性髓系白血病患者血液和健康人血液各80例。
[0077] 2、RNA提取过程同实施例1。
[007引 3、逆转录：
[0079] 1)将2y邑的总RNA模板与1y1 2yMmiRNA逆转录引物、1y1 2yMUSsnRNA逆 转录引物、1y1dNTP(IOmM)混合物和无RNase的去离子水混合，终体积为20y1。混匀后， 于65°C解育5min。
[0080] 。立即在冰上冷却。再依次加入W下成分：4y1 5X缓冲液、2y1DTT化1M)、 1y1核糖核酸酶（RNase)抑制剂，将溶液混匀，37 °C溫育5min。
[0081] 3)加入1y1M-MLV逆转录酶，混匀后37 °C反应比。
[0082] 4)置于70°C，15min，终止反应，-20°C冻存备用。miRNA逆转录引物序列如序列表 中SEQIDNO. 2所示，USsnRNA逆转录引物序列如序列表中SEQIDNO. 3所示。
[0083] 4、QPCR反应：
[0084] 采用25y1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复=次W上W 保证结果的可靠性。配制W下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12. 5y1，正向引 物巧yM) 1y1，反向引物巧yM) 1y1，模板CDNA2. 0y1，无酶水8. 5y1。各项操作均于冰 上进行。扩增程序为：95°ClOmin，（95°C20s，56°C55s)X50 个循环。WSYBRGreen作为 巧光标记物，在Li曲t切cler巧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA-548a-化 的正向引物序列如SEQIDNO. 4所示，反向引物为如SEQIDNO. 5所示。WUSsnRNA作为 参照基因，其上游引物序列为SEQIDN0.6所示；下游引物序列为SEQIDN0.7所示。通过 融解曲线分析和电泳确定目的条带，AACT法进行相对定量。
[00财 5、结果
[0086] 如图1所示，与健康人的血液相比，急性髓系白血病患者血液中miRNA-548a-化的 表达水平显著升高，与miRNA忍片结果一致。
[0087] 实施例3miRNA-548a-化在急性髓系白血病细胞系中的表达
[008引 1、细胞培养
[0089]将急性髓系白血病细胞株U937,KG-I，THP和从AML患者与健康人中分离的骨髓单 个核细胞的用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养，置于37°C、5%C〇2培养箱中。
[0090] 2、QPCR
[0091] 2. 1细胞总RNA提取：利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取， 按照说明书指示进行。
[009引 2. 2QPCR:步骤同实施例2。
[009引 3、结果
[0094] 如图2所示，与健康人骨髓单个核细胞相比，急性髓系白血病细胞株U937,KG-1， THP及AML患者的骨髓单个核细胞中miRNA-548a-化的表达明显升高（P<0. 05)。
[0095] 实施例4研究miRNA-548a-化对急性髓系白血病细胞增殖能力的影响
[0096] 1、设计合成针对miRNA-548a-化的反义寡核巧酸（anti-miRNA-548a-化）
[0097] 根据miRNA-548a-化的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成 anti-miRNA-548a-化和随机对照序列。
[0098] 2、细胞培养：U937细胞培养方法同实施例3。
[009引 3、细胞转染
[0100] 将U937细胞分为两组，分别为抑制阴性对照组（anti-NC)、miRNA-548a-化 抑制组（anti-miRNA-548a-化）。将阴性对照组及抑制组分别转染anti-NC和 anti-miRNA-548a-3p，运用转染试剂LipofectamineTM2000进行转染，转染方法参照说明 书。anti-NC和anti-miRNA-548a-化的工作浓度均为5yM。转染后4化收集各组细胞用 于后续实验。
[OW] 4、QPCR实验
[0102] 细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例3。
[0103] 结果如图3所示，与抑制阴性对照组（anti-NC)相比，miRNA-548a-化抑制组 (anti-miRNA-548a-3p)的miRNA-548a-化的水平显著下降，表明anti-miRNA-548a-化能够 有效抑制miRNA-548a-化的表达。
[0104] 5、细胞增殖实验
[0105] 将转染4她的U937细胞使用0. 25 %膜酶消化成细胞悬液，W5XIO4个/ml接种 于96孔细胞培养板，每孔0. 1ml，60min后，MlT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收 值大小代表活细胞的相对数量。
[0106] 6、结果
[0107] miRNA-548a-：3p抑制组（anti-miRNA-548a-3p)相对光密度值为 0. 214 + 0. 041，抑 制阴性对照组（anti-NC)相对光密度值为1. 504 + 0. 126。与抑制阴性对照组（anti-NC)相 tt，miRNA-548a-：3p抑制组（anti-miRNA-548a-3p)光吸收值显著下降（P<0. 05)。上述实验 结果表明anti-miRNA-548a-化能够显著抑制U937细胞增殖能力，同时表明miRNA-548a-化 有利于U937细胞增殖。
[010引上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. miRNA-548a-3p在制备抗急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于，所述 miRNA-548a-3p的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物包含miRNA-548a-3p抑制剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的miRNA-548a-3p抑制剂能够抑制 miRNA-548a-3p的表达或者能够抑制miRNA-548a-3p的功能。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述miRNA-548a-3p抑制剂是 miRNA-548a-3p的反义寡核苷酸或拮抗剂。5. -种治疗急性髓系白血病的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求2-4任一项 所述的miRNA-548a-3p抑制剂。 6. miRNA-548a-3p在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通量测序获知待测 样本miRNA-548a-3p的表达水平，分析获知miRNA-548a-3p与急性髓系白血病的发生发展 相关。 7. miRNA-548a-3p在制备诊断急性髓系白血病产品中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的产品包括芯片或试剂盒。其中， 所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探 针包括特异性地对应于miRNA-548a-3p的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测 miRNA-548a-3p的表达水平的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中的试剂包括针对 miRNA-548a-3p的引物和/或探针。10. -种诊断急性髓系白血病的产品，其特征在于，所述的产品包括权利要求8或9所 述的芯片或试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及miRNA-548a-3p在抗急性髓系白血病中的应用。miRNA-548a-3p可用于诊断病人是否患有急性髓系白血病。经实验证明，miRNA-548a-3p可以有效地区分急性髓系白血病样本和健康人的样本。miRNA-548a-3p还可以用于制备治疗急性髓系白血病的药物。本发明大大提高了急性髓系白血病诊断的敏感性和特异性，同时为急性髓系白血病的基因治疗提供了新的靶点。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K31/7088, A61K48/00, A61P35/02, A61K45/00
【公开号】CN105169393
【申请号】
【发明人】董东, 杨承刚
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月31日