miRNA-548a-3p抗急性髓系白血病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地设及miRNA-548a-化在抗急性髓系白血病中的 应用。
【背景技术】
[0002] miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因 沉默对祀基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。 miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与祀基因mRNA5' -UTR或者3' -UTR中的互补序列 相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控祀基因的表达。
[0003] 急性髓系白血病（AcuteMyeloidLeukemia,AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，也 称急性非淋己细胞性白血病，常进展迅速。其特点是造血干细胞健康分化受阻，恶性肿瘤细 胞克隆性增生取代健康造血，从而造成贫血、出血、感染及脏器浸润等一系列症状。近年来， AML发病率呈逐渐上升的趋势，尽管现有治疗方法使患者完全缓解率可达50%~70%，但 该病病死率仍较高，对不同患者实施个体化分层治疗成为首要问题。综合研究基因对AML 发生发展的作用及其预后影响，有助于探寻有效的抗白血病血管生成治疗祀点，从而进一 步指导临床个体化治疗。
[0004] 检测miRNA的表达水平可W为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达 直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA 可W通过调控祀基因mRNA的表达，在急性髓系白血病中起重要作用。本发明首次发现 miRNA-548a-化的在急性髓系白血病患者中的表达量远远高于对照正常组，miRNA-548a-化 的表达异常和急性髓系白血病的发生发展相关，运为急性髓系白血病的miRNA的临床治疗 提供了基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种miRNA-548a-化在抗急性髓系白血病中的应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了miRNA-548a-化在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，所述 miRNA-548a-化的核巧酸序列如沈QIDNO. 1所示。本发明的实验证明miRNA-548a-化的 表达水平与急性髓系白血病相关，在此基础上，通过抑制miRNA-548a-化的表达来达到治 疗急性髓系白血病的目的。
[0008] 进一步，所述药物包含miRNA-548a-化抑制剂。所述miRNA-548a-化抑制剂能够 抑制miRNA-548a-化的表达或者能够抑制miRNA-548a-化的功能。
[0009] 进一步，miRNA-548a-化抑制剂包括蛋白、寡核巧酸、小分子化合物。
[0010] 优选地，所述miRNA-548a-化抑制剂是miRNA-548a-化的反义寡核巧酸或括抗剂。
[0011] 本发明提供了一种治疗急性髓系白血病的药物，所述药物包括上述的 miRNA-548a-化抑制剂。
[0012] 根据miRNA-548a-化序列设计出它的特异性反义寡核巧酸，将反义寡核 巧酸转移到人体内后，它们能够明显下调miRNA-548a-化的表达。"反义寡核巧酸 (antisense-oligonucleotides,AS-Ons或AS0)"又称为"反义核巧酸"，是指长度约为 18-26nt(更特别的约19-2化t)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
[0013] 在本发明中，所述的"反义寡核巧酸"还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰 技术等手段获得的经修饰的反义核巧酸，所述的修饰基本不改变反义寡核巧酸的活性，更 佳地，所述修饰可提高反义寡核巧酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁（lockednucleic acid,LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技 术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改 善，且易于大量合成。寡核巧酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核巧酸链 硫代修饰为硫代脱氧核巧酸链。该方法是将DNA骨架上的憐酸键的氧原子用硫原子替代， 可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核巧酸的大部分或全部活性的修饰 都包含在本发明中。
[0014] 本发明的治疗急性髓系白血病的药物还包含药物学上可W接受的载体，所述载体 包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷 雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
[0015] 所述药物可W制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉 剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可W按照药学领域的常规方法制备。
[0016] 所述药物可W单独施用或者与其他能够抑制急性髓系白血病的药物进行组合施 用。
[0017] 所述药物可W离体施用：将miRNA-548a-化的反义寡核巧酸或者括抗剂、 miRNA-548a-化反义寡核巧酸的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞（或异种 细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。
[001引所述药物可W体内施用：将miRNA-548a-化的反义寡核巧酸或者括抗剂、miRNA-548a-化反义寡核巧酸的表达载体直接导入体内。运种载体可W是病毒型或非病毒 性，甚至是裸DNA或RNA。
[0019] 所述的受试者可W是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组织、细 胞。
[0020] 本发明的核酸分子可W是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0021] 本发明提供了miRNA-548a-化在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获 知待检测样本中miRNA-548a-化的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容 易判断待测样本是否患有急性髓系白血病W及患急性髓系白血病的风险。因此，通过高通 量测序获得miRNA-548a-化表达水平与急性髓系白血病相关性的应用同样包含在本发明 的保护范围之内。
[0022] 本发明提供了miRNA-548a-化在制备诊断急性髓系白血病产品中的应用。
[0023] 进一步，所述产品包括忍片或试剂盒。
[0024] 进一步，所述忍片包括固相载体；W及固定在所述固相载体上的寡核巧酸探针，所 述寡核巧酸探针包括特异性地对应于miRNA-548a-化的部分或全部序列。所述试剂盒包括 用于检测miRNA-548a-化的表达水平的试剂。
[00巧]进一步，所述寡核巧酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断急性 髓系白血病的miRNA的寡核巧酸探针，将多种miRNA的检测探针放置在同一忍片上通过检 测多种miRNA指标联合判断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0026] 进一步，所述的试剂盒中的试剂包括针对miRNA-548a-化的引物和/或探针。所 述试剂还包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断急性髓系白血病的miRNA的引物和/ 或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指 标联合判断急性髓系白血病的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0027] 进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因忍片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醒基、氨基等）修饰的玻片或娃片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0028] 所述的miRNA忍片的制备可采用本领域已知的生物忍片的常规制造方法，例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或娃片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核巧 酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或娃片上，排列成预定的序列或阵 列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA忍片。
[0029] 本发明的miRNA-548a-化可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表达 miRNA-548a-化的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
[0030] 病毒载体可W是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、瘤疹病毒（例如单纯瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0031] 真核表达载体可W是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 PCDNA3. 0表达载体、PCDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表 达载体、PTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如地in438、 PCAMBIA1301等。
[0032] 应当知道，本发明的miRNA-548a-化包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体。
[0033] 本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可W在miRNA的一端或者两端增加保 护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术 人员熟知，在不影响miRNA-548a-化功能的条件下，对miRNA-548a-化进行碱基修饰或者在 两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0034] 本发明提供了一种诊断急性髓系白血病的产品，所述的产品包括上面所述的忍片 或试剂盒。
[0035] 本发明的优点和有益效果：
[0036] 本发明首次发现了miRNA-548a-化表达与急性髓系白血病相关，通过检测受试者 血液中miRNA-548a-化的表达水平，可W判断受试者是否患有急性髓系白血病或者判断受 试者是否存在患有急性髓系白血病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者 治疗方案。
【附图说明】
[0037] 图1显示利用QPCR检测miRNA-548a-化在急性髓系白血病患者血液中的表达情 况；
[0038] 图2显示利用QPCR检测miRNA-548a-化在急性髓系白血病细胞系中的表达情况；
[0039] 图3显示anti-miRNA-548a-化对miRNA-548a-化表达的抑制作用。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 实施例1与急性髓系白血病相关的miRNA的筛选
[0044] 1、样本获取：各收集10例健康人血液样本和急性髓系白血病患者血液样本。上述 所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[004引 2、样本总RNA的提取
[0046] 使用U-gene公司的BloodRNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
[0047] 1)每体积新鲜血液（最大Iml)加入5倍体积的1XXR-I缓冲液，例如：每Iml血 液中加入5ml的XR-I缓冲液，縱满振荡混匀；
[0048] 2)冰浴15分钟，在縱满振荡器上迅速混匀两次，溶液变清表明红血细胞已裂解。 如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，延长冰浴时间至20min;
[0049] 3) 4°C下450g离屯、IOmin沉淀白细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液；
[0050] 4)用2倍体积的XR-I缓冲液洗涂在步骤1中用到的每体积的全血，縱满振荡W完 全悬浮细胞；
[0051] 5)4°C下450g离屯、lOmin，并再次去掉上清；
[005引 6)往成团的白细胞中加入XR-II溶解缓冲液/2 -琉基乙醇，縱满振荡充分混匀。 500y1W下的全血就加入400y1XR-II溶解缓冲液，如果在步骤1中用到的是0. 5~ 1.Oml的血液，贝阳日650y1XR-II溶解缓冲液。在加入XR-II溶解缓冲液之后，样品应保存 于一70°C的条件下；
[005引 7)加入等体积的70%乙醇，縱满振荡混匀；
[0054] 8)把所有的样品（包括所有的沉淀）加到一个固定在一个2ml收集试管上的 Mu-PuRNA分离柱上。10,OO