养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0. 7mL， 加入不含小牛血清的RPMI1640培养液和MTT (5mg ? mL \每孔50 y L)。培养结束后，每孔 加入酸性异丙醇lmL，吹打混匀，波长570nm处用酶标仪测定吸光度值(A值)。淋巴细胞的 增殖能力用加ConA孔的A值减不加ConA孔的A值表示。
[0032] 2. 3体液免疫功能测定以抗体生成细胞检测测定药物对小鼠体液免疫功能的影 响，采用Jeme改良玻片法。每鼠腹腔注射2%SRBC悬液0. 2mL，免疫后4d，处死小鼠，取脾，用 HanK液制成细胞悬液，筛孔内径（75. 0±4. 1) ym (200目）筛网过滤，洗涤、离心2次，最后 将细胞悬浮在HanK液5mL中。将表层培养基加热溶解后与等量pH值7. 4、2倍浓度的HanK 液混合，分装小试管，每管0. 5mL。再向管内加入用HanK液配制的10%SRBC悬液50 y L、脾 细胞悬液20 yL，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，凝固后，放入二氧化碳培养 箱中温育1. 5h，加HanK液稀释的补体（1 :10)，继续温育1. 5h后计数溶血空斑数。
[0033] 2. 4单核-巨噬细胞吞噬功能测定采用小鼠碳廓清实验检测小鼠单核-巨噬细 胞吞噬功能。小鼠尾静脉注射10mL ? kg 1以0. 9%氯化钠溶液稀释4倍的印度墨汁，立即 计时，注入墨汁后第2,10分钟，从内眦静脉丛取血20 yL，加到0. 1%碳酸钠溶液2mL中，摇 匀，600nm波长处测A值。处死小鼠，取肝、脾称重，按下式计算吞噬指数：吞噬指数（a )= K1/3X体重/ (肝重+脾重)。式中K= (lgAflgAj/ (t2-ti)。A#2min时吸光度，厶2为 lOmin时吸光度，分别为2, lOmin。
[0034] 2.5 NK细胞活性测定采用乳酸脱氢酶（LDH)测定法检测NK细胞活性。实验前 24h将YAC-1细胞进行传代培养，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4 X 105个*1^ 1。 动物给完药后无菌取脾，置于盛有适量无菌HanK液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制 成单细胞悬液。经筛孔内径（75. 0±4. l)ym (200目）筛网过滤，加入0. 5mL灭菌水20s裂 解红细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2 X 107个? mL 1。取YAC-1细胞和脾细 胞各100 y L，加入96孔培养板中；祀细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 y L，靶细胞 最大释放孔加靶细胞和2. 5%Triton各100 y L ;上述各项均设3个复孔，于37°C、5%C02培养 箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r ? min 1离心5min，每孔吸取上清液100 y L置平 底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 y L，反应3min，每孔加入lmol ? L 1盐酸溶液 30 y L，在酶标仪490nm处测定A值。
[0035] NK细胞活性（％)=(反应A值-自然释放孔A值）/(最大释放孔A值-自然释放 孔A值）X100%。
[0036] 2. 6统计学方法用Excel、SPSS10. 0软件进行数据转化和统计分析。方差齐性检 验合格后，采用dunnet单因素多重比较统计分析。
[0037] 3 结果 3.1本发明药物对小鼠细胞免疫功能实验在小鼠迟发型变态反应实验中，本发明药 物组及阳性对照组足跖增厚值与阴性对照组比较，差异有极显著性。表明本发明药物液能 增加小鼠迟发型变态反应。对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验，本发明药物组及阳性 对照组A值差值高于阴性对照组，差异有显著性。表明本发明药物能提高小鼠脾淋巴细胞 转化的能力。结果见表1-1。
[0038] 3. 2对小鼠体液免疫功能的影响对小鼠抗体生成细胞的影响见表1-1。本发明药 物组及阳性对照组小鼠溶血空斑数均高于阴性对照组，对比药物A组、对比药物B组、对比 药物C组对小鼠体液免疫功能的影响不明显。表明本发明药物能够提高小鼠的抗体生成细 胞数，提示本发明药物具有增强小鼠体液免疫的功能。
[0039] 表1-1各组小鼠迟发型变态反应和脾淋巴细胞转化和抗体生成细胞数结果（ ^ ±s)
注：与阴性对照组比较，*P〈〇. 01，#P〈〇. 05 3.3本发明药物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响经方差分析和统计学两两比 较，发现本发明药物组及阳性对照组小鼠的碳廓清吞噬指数A均高于阴性对照组，差异有 极显著性（P〈〇. 01)，表明本发明药物具有增强小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的作用，对比 药物A组与对比药物B组作用不明显，见表1-2。
[0040] 3.4本发明药物对小鼠NK细胞活性的影响经方差分析和统计学两两比较，发现 本发明药物组及阳性对照组小鼠的NK细胞活性均高于阴性对照组，差异有显著性。表明本 发明药物各剂量具有增强小鼠NK细胞活性的作用。结果见表1-2。
[0041] 表1-2各组小鼠单核-巨噬细胞碳廓清和NK细胞活性的检测结果(i± s)
注：与阴性对照组比较，*P〈〇. 05 4讨论与结论 本发明药物能增加小鼠迟发型变态反应，可增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化增 殖能力，有增强细胞免疫功能作用；提高小鼠的抗体生成细胞数，有增强体液免疫功能作 用；有增强小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能及增强小鼠NK细胞活性的作用。表明本发明药物 具有增强小鼠细胞和体液免疫功能及非特异性的作用。
[0042] 特别是，本发明药物的作用效果明显优于对比药物A与对比药物B，说明本发明药 物中两种药味之间的配伍精良，缺一不可，两种药味之间的组合产生了明显的协同增效作 用，产生了一加一大于二的技术效果。
[0043] 实验二：本发明药物的质量检测方法研究 1仪器与试药 1. 1仪器 高效液相色谱仪（AgilentllO高效液相色谱仪及工作站，G1311Aquat栗，G1314紫外检 测器)。
[0044] 1. 2 试药 木犀草素（luteolin)对照品（中国药品生物制品检定研究院）;本发明中药组合物胶囊 (参考本发明说明书实施例4制备）；中药材(康济连锁药店提供）；甲醇(色谱醇，上海生化工 助剂厂）；其他试剂为分析纯。
[0045] 2方法与结果 2. 1处方 奸须草500g，待霄草500g。
[0046] 2. 2 制备 取干燥的虾须草500g，待霄草500g，第一次加llOOOmL水浸泡1小时，煎煮1小时，第 二次加4000mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。
[0047] 2. 3木犀草素（luteolin)的含量测定 2. 3. 1 HPLC色谱条件 采用C18(4. 0_X125mm，5ym)色谱柱；流动相：比例为35 :65的甲醇-水；检测波长： 206nm ;柱温：22°C ;流速：0. 8mL ? min S进样量：10 y L ;在该色谱条件下，对照品及样品色 谱峰良好，无防己阴性对照对测定无干扰。
[0048] 2. 3. 2对照品溶液的制备 精密称取80°C干燥至恒重的木犀草素（luteolin)对照品适量，加甲醇制成每lmL含 0? 2mg的溶液。
[0049] 2. 3. 3供试品溶液与阴性对照液的制备 精密称取本发明药物l〇g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残 渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试 液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶 中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；另按处方比例制备不含防己的颗粒剂阴性对照 品，同法制成阴性对照液。
[0050] 2. 3. 4标准曲线的绘制 精密称取80°C干燥至恒重的木犀草素（luteolin)对照品适量，用甲醇制成10. 4， 20. 8,41. 6,83. 2,166. 4 y gmL 1系列浓度的溶液，分别精密量取上述5种浓度溶液各10 y L， 注入高效液相色谱仪进行测定。
[0051] 以峰面积比值与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=21. 2763C-0. 1391， r=0. 9999。表明木犀草素（luteolin)在10. 4~166.4 ygmL1浓度范围内呈良好的线性关 系。
[0052] 2. 3. 5稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 y L，分别于0,1，2,4,8h进样