酶解蛋白沉析，混合液栗入分离机中，进 行固液分离，流出物全部为酸溶大豆肽。固相物为非水溶性成分，加碱中和，烘干后可作为 豆渣干饲料；
[0036] 4?脱除异味
[0037] 大豆肽在酶解度低或大豆中呈味物质一一异黄酮、皂苷等未经分离提取处理时， 常具有令人难以接受的异味，为脱除异味，可将大豆肽液通过活性炭柱进行处理，大豆肽 液与活性炭比约为1 :1〇(即通过时的大豆肽液流量是活性炭粒体积的1/10)，过柱温度 ~40°C，经过活性炭处理后，即可得到色泽透明、基本无味的大豆肽液；
[0038] 5.脱除无机盐类
[0039] 经过阴阳离子交换树脂脱除无机盐。
[0040] 6?杀菌灭酶
[0041] 经脱味、除盐处理后的大豆肽液，高温杀菌灭酶。
[0042] 7.浓缩、喷雾干燥
[0043] 经过杀菌灭酶的大豆肽液，栗入蒸汽压力为180KPa、真空度为90Kpa、温度为55°C 的双效浓缩装置，浓缩浓度达到~40 %，栗入压力式喷雾干燥塔中，进口温度为170°C，出 口温度80°C，所得产品为"高免疫活性大豆肽"。
[0044] 实施例3
[0045] 免疫活性评价实验
[0046] 动物：小鼠，健康昆明种，体质量（25 士 2)g，均为SPF级（无特定病原体），由泰安 泰邦公司提供。
[0047] 受试产品：实施例2产品"高免疫活性大豆肽"
[0048] 动物分组及给药：
[0049] 预试3d，在预试期间对小鼠进行驯养观察，观察其对新环境的适应状况，训练其定 点采食；喂料的每日供给量根据投饲率表确定，并根据摄食情况作相应调整。投喂遵循定 点、定时、定量、定质的原则。淘汰掉体质和运动能力与平均有明显差异的小鼠。预试3d后， 将小鼠随机分为4组，每组40只：对照组，高免疫活性大豆肽低、中、高剂量组第7d早晨空 腹称体重量开始实验，对照组灌胃300mg?kg1d1生理盐水，低、中、高剂量组均分别灌胃 lOOdOOJOOmg^kg1d1高免疫活性大豆肽，连续灌胃30d。每天观察小鼠的饮水、精神、毛 发和大小便等状况。
[0050] 1.高免疫活性大豆肽对小鼠免疫器官重量及其指数的影响
[0051] 将小鼠正常饲养，按时给药。实验至第30d时，每剂量组及对照组各取小鼠10只。 于给药结束后，称体重，处死取脾脏及胸腺称重。计算免疫器官指数。免疫器官指数以免疫 器官重量与体重的比值表示。实验结果见表1。
[0052] 表1高免疫活性大豆肽对小鼠免疫器官重量指数的影响=
[0053] Table1effectsofpeptideontheweightofimmuneorgansinmice
[0054]
[0055] 注：*表示p〈0.05, _表示p〈0.01，与对照组比较
[0056] 由表1中数据分析，高免疫活性大豆肽各剂量组均可以通过促进脾脏和胸腺发育 而提高机体的免疫能力，高剂量组可显著性提高正常小鼠的胸腺和脾脏指数，对动物的基 础免疫水平有明显的提高作用。
[0057] 2.高免疫活性大豆肽对小鼠血清免疫球蛋白（IgG)含量的影响
[0058] 饲养30d后，每组取出10只，眼球取血，并分离得到血清。取小鼠血清20yL， 加入缓冲液lmL混匀，再取稀释的血样20yL血清，另加入缓冲液lmL混匀，然后按IgG 放免试剂盒具体操作说明进行测定。测定结果见表2。
[0059] 表2高免疫活性大豆肽对正常小鼠IgG含量的影响@ ±
[0060] Table2effectsofpeptideonIgGcontentinnormalmice ?M)
[0061]
[0062] 分析表2数据可知，产品各剂量组均能提高小鼠血清中IgG含量，且高剂量的提 高作用最明显。说明高免疫活性大豆肽能够很大程度提高机体体液免疫能力。
[0063] 3.高免疫活性大豆肽对小鼠NK细胞活性的影响
[0064] 实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank'S液洗3次，用RPM1-1640完全 培养液调整细胞浓度为4X105个/mL。
[0065] 制备脾细胞悬液。各组动物无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank'S液平皿中，用镊 子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank'S液洗2次，每次离心 lOmin(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，用灭菌注射用水裂解红细胞后，加入1 %冰醋酸 稀释细胞悬液。调整脾细胞悬液的浓度为2X107后，加入96孔板中培养。每个动物分成： 反应孔（脾细胞悬液和YAC-1细胞悬液各100yL，效靶比为50 : 1);自然释放孔（YAC-1 细胞悬液和培养液各100yL);最大释放孔（YAC-1细胞悬液和1 %NP40各100yL)。以上 各项均做3个平行管。96孔板在37°C，5%C02培养箱中培养4h，加入LDH基质液和ImoL/ LHC1后，合并各平行孔的溶液，在酶标仪490nm处测定光密度值（0D)。计算NK细胞活性。
[0066]
[0067] 结果见表3。
[0068] 表3高免疫活性大豆肽对正常小鼠脾细胞NK活性的影响
[0069] Table3effectsofpeptidesonNKactivityofspleencellsinmice
[0070]
[0071] 注：*表示p〈0.05, *表示p〈0.01，与对照组比较
[0072] 表3表明产品各剂量组小鼠NK细胞活性均有增强。中、高剂量组都具有显著性。
[0073] 4.高免疫活性大豆肽对巨噬细胞吞噬功能的影响
[0074] 饲养30d后，每组取出10只，每只鼠腹腔注射lmL20%的鸡红细胞悬液；3〇1^11后 处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2mL。转动鼠板lmin，然后， 吸出腹腔洗液lmL，平均分滴于2片载玻片上，37°C温育30min;之后用生理盐水漂洗，晾干， 以1 :1的丙酮甲醇溶液固定，4%Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油 镜下计数100个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。
[0075]
[0076] 结果见表4。
[0077] 表格4高免疫活性大豆肽对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响S±
[0078] Table4effectsofpeptidesonphagocytosisofmacrophageinmice
[0079]
[0080] 注：*.表示p〈0. 05，*《表示p〈0. 01，与对照组比较
[0081] 由表4中数据可知，各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数与对照组相 比，整体表现上升趋势，其中中、高剂量组具有极显著的差异，能显著促进小鼠腹腔巨噬细 胞的吞噬功能。
【主权项】
1. 一种微量热法结合免疫活性评价实验确定高免疫活性大豆肽的制备方法，其特征 在于：采用微量热法确定水解大豆分离蛋白的最适蛋白酶、最适pH、最适温度；结合免疫活 性评价实验确定高免疫活性大豆肽的制备方法。2. 如权利要求1所述一种微量热法结合免疫活性评价实验确定高免疫活性大豆肽的 制备方法，其特征在于，利用微量热法分别测出中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性 蛋白酶在不同温度（306. 15K-336. 15K)时水解大豆分离蛋白的热功率一时间曲线，分别计 算出各酶解反应的米凯利斯常数和最大反应速率，定量得到上述蛋白酶水解大豆分离蛋白 的最适温度。3. 如权利要求1所述一种微量热法结合免疫活性评价实验确定高免疫活性大豆肽的 制备方法，其特征在于，还利用微量热法测出中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋 白酶在不同pH(pH6. 13-pH9. 22)时水解大豆分离蛋白的热功率一时间曲线，分别计算出各 酶解反应的米凯利斯常数和最大反应速率，定量得到上述蛋白酶水解大豆分离蛋白的最适 pH。4. 如权利要求1所述一种微量热法结合免疫活性评价实验确定高免疫活性大豆肽的 制备方法，其特征在于，所述最适蛋白酶为碱性蛋白酶；其水解大豆分离蛋白最适PH为 8. 25 ;最适温度为329. 5K;所述高免疫活性大豆肽的制备方法为调浆一加酶反应一分离提 取一脱除异味一脱除无机盐类一杀菌灭酶一浓缩、喷雾干燥一高抗疲劳活性大豆肽产品。 其中加酶反应底物浓度5% -10%、pH值8. 25、酶底比1-3%、水解温度329. 5K，碱性蛋白酶 水解大豆蛋白3h后加与碱性蛋白酶1:3的中性蛋白酶，在319. 19K，pH7. 13水解lh，获得 高免疫活性大豆肽。
【专利摘要】本发明公开了一种微量热法结合免疫活性评价实验确定高免疫活性大豆肽的制备方法，属于大豆深加工技术领域。是采用微量热法根据酶解反应的米凯利斯常数比较得到制备高免疫活性大豆肽最适蛋白酶为碱性蛋白酶。结合产物免疫活性评价实验得到一种高免疫活性大豆肽的制备方法。本发明能够有效提高产品的免疫活性，免疫活性评价实验结果表明本发明能够更显著提高产品的免疫活性，吞噬细胞吞噬率可达57.23％，IgG含量可达119.53mg/100ml,NK细胞活性可达26.46％。本发明无污染，成本低，工艺简单，产品免疫活性高，水溶性好、安全、无毒、无副作用，具有较高的推广价值，可产生较高经济价值和社会效益，其前景非常广阔。
【IPC分类】A23J3/16, A23J3/34
【公开号】CN105166321
【申请号】
【发明人】李向阳, 董海洲, 刘季善, 张立国, 燕效云
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月18日