一种微量热法结合免疫活性评价实验确定高免疫活性大豆肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于大豆深加工技术领域，尤其是一种微量热法结合免疫活性评价实验确 定高免疫活性大豆肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 免疫活性肽不仅能够刺激机体自身淋巴细胞的增殖、促进细胞因子的释放、增强 机体巨噬细胞的吞噬能力，而且不会引起机体的免疫排斥反应。与用于提高机体免疫能力 的大分子药物相比，免疫活性肽有明显的优势，它能充分调动了机体自身免疫系统的主动 性，促进机体自身免疫能力的提高，近年来免疫活性肽作为一类小分子物质，以其分子量 低、活性强、用量少的独特优势，已越来越多地引起人们的重视。
[0003] 大量研究证明大豆蛋白经蛋白酶水解形成的大豆肽中具有免疫活性成分，但这些 大豆肽产品免疫活性成分含量不是很高。对蛋白酶水解制备大豆肽的方法国内外学者进行 了大量的研究，大都是通过测定产物的性质，来确定最佳反应温度、酸度等条件，试验方法 较复杂，随意性较大，不能准确定量确定蛋白酶水解反应的最佳工艺。致使蛋白酶水解工艺 控制欠缺理论指导，控制难，产品得率低。微量热法具有灵敏度高、操作简单等优点。本发 明旨在利用微量热法通过高灵敏度的微量量热仪直接测量酶催化反应过程中微量的热量 变化，获得蛋白酶对大豆蛋白催化反应的热功率一时间曲线，定量确定蛋白酶水解大豆分 离蛋白最佳反应温度、pH。本发明利用微量热法结合免疫活性评价实验可以更准确地定量 确定高免疫活性大豆肽的制备方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供一种制备高免疫活性大豆肽的方 法。本发明用一种新的研究方法微量热法，对大豆蛋白酶解制取大豆肽最适蛋白酶、最 适条件进行定量的研究，结合免疫活性评价实验确定一种新的高免疫活性大豆肽的制备方 法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种微量热法结合免疫活性评价实 验确定高免疫活性大豆肽的制备方法，步骤如下；
[0006] 1.配制溶液：
[0007] 溶液①：准确称取大豆分离蛋白样品，用不同pH值（pH3. 3-pH10. 0)的缓冲溶液分 别配制浓度为5-10gL1的大豆分离蛋白溶液。
[0008] 溶液②：配制浓度为〇? 1-0. 3gL1的中性蛋白酶（酶活力5. 3X10 4U/g)溶液，胰 蛋白酶（酶活力5.IX104U/g)溶液，菠萝蛋白酶（酶活力6.OX104U/g)溶液，碱性蛋白酶 (酶活力5.7X104U/g)溶液。
[0009] 2. 90°C大豆分离蛋白溶液进行水浴处理lOmin;
[0010] 3.测定热功率时间曲线：取溶液①2ml放入不锈钢安瓿中。把滴定微量量热仪的 连杆上绕细塑料管，管中盛蛋白酶溶液②lml，先预热，当温度（306. 15K-336. 15K)恒定后， 将搅拌系统打下，转速为60-120rpm，用蠕动栗把蛋白酶溶液②注入安瓿中，然后进行热功 率一时间曲线的测定；
[0011] 4.通过热功率一时间曲线，按照热动力学理论和对比进度法解析出中性蛋白酶、 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶各温度（306. 15K-336. 15K)、pH值（pH6. 13-pH9. 22) 时米凯利斯常数Km和最大速度Vmax，并建立米凯利斯常数与温度、pH值间的关系式，从 而获得中性蛋白酶最适温度319. 19K、最适pH7. 13;胰蛋白酶最适温度323. 27K、最适 pH7. 77 ;菠萝蛋白酶最适温度314. 63K、最适pH6. 99 ;碱性蛋白酶最适温度329. 5K、最适 pH8. 25 〇
[0012] 5.通过热功率一时间曲线，求得中性蛋白酶在其最适温度、最适pH的米凯利斯 常数Km= 24. 02g吨\胰蛋白酶在其最适温度、最适pH的米凯利斯常数Km= 42. 41g*L\ 菠萝蛋白酶在其最适温度、最适pH的米凯利斯常数Km= 50. 31g*L\碱性蛋白酶在其最 适温度、最适pH的米凯利斯常数Km= 16.Olg吨\从而可以知道碱性蛋白酶与底物大豆 分离蛋白的亲和力最强，结合免疫活性评价实验进一步确定碱性蛋白酶是催化水解大豆分 离蛋白的最适蛋白酶。
[0013] 6.不同试验条件（底物浓度、酶底比、pH、温度、酶组合）下得到的大豆肽产品进 行免疫活性评价实验，通过试验结果确定高免疫活性大豆肽制备方法：为大豆蛋白放入带 有搅拌器的控温酶反应器罐中，加水调浆，浆料浓度约5-10% ;调浆后，按底物蛋白重的 1-3%加入碱性蛋白酶，边加酶，边搅拌，随时加碱，保持pH值~8. 25,搅拌速度=60-120r/ min，酶解温度保持在329. 5K左右，酶解3小时后，加与碱性蛋白酶1:3的中性蛋白酶，在 319. 19K，pH7. 13水解lh后经分离提取一脱除异味一脱除无机盐类一杀菌灭酶一浓缩、喷 雾干燥，获得高免疫活性大豆肽。
[0014] 本发明的有益效果是：本发明使用的微量热法具有灵敏度高，操作简单、实验结果 精准等优点；本发明提供一种制备高免疫活性大豆肽的方法，能够有效提高产品的免疫活 性，经免疫活性评价实验证明，本发明能够更显著提高产品的免疫活性，吞噬细胞吞噬率可 达57. 23%，IgG含量可达119. 53mg/100ml，NK细胞活性可达26. 46%。本发明无污染，成 本低，工艺简单，产品免疫活性高，水溶性好、安全、无毒、无副作用，具有较高的推广价值， 可产生较高经济价值和社会效益，其前景非常广阔。
【附图说明】
[0015] 图1在pH= 6. 50,不同温度时中性蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线
[0016] 图2在T= 318. 15,不同酸度时中性蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线
【具体实施方式】：
[0017] 以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是实施例只用于对本发明作 进一步说明，不代表发明保护范围，其他人根据本发明提示作出的非本质的修改和调整，仍 属于本发明保护范围。
[0018] 实施例1
[0019] 1?溶液的配制：
[0020] 溶液①：准确称取大豆分离蛋白样品，用pH值为6. 13、6. 60、7. 10、7. 61、8. 03的缓 冲溶液分别配制浓度为l〇gL1的大豆分离蛋白溶液。
[0021] 溶液②：配制浓度为0.2gL1中性蛋白酶溶液。
[0022] 2. 90°C大豆分离蛋白溶液进行水浴处理lOmin;
[0023] 3?实验是在4ml不锈钢安瓶（滴定微量量热仪）中进行的。取大豆分离蛋白溶液 2ml放入不锈钢安瓿中。把滴定微量量热仪的连杆上绕细塑料管，管中盛碱性蛋白酶溶液 lml，先预热，当温度（306. 15K;311. 15K;316. 15K;321. 15K;326. 15K)恒定后，将搅拌系统 打下，转速为120rpm，用蠕动栗把中性蛋白酶溶液注入安瓿中，然后进行热功率一时间曲线 的测定，记录仪开始记录，当记录笔画出与基线平行的直线时即认为实验结束，搅拌停止。 每个体系重复实验测定三次，取平均值。
[0024] 实验测得在pH= 6. 50,不同温度时中性蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线如 图1，由图1得到不同温度（306. 15K;311. 15K;316. 15K;321. 15K;326. 15K)下中性蛋白酶 催化反应的米凯利斯常数（Km)和最大速率（Vmax):
[0025]T= 306. 15K，Kn= 36. 12 和V_=0?1207;T= 311. 15K，Kn= 31. 93 和V_ = 0? 1351;T= 316. 15K，Kn= 29. 64 和V_= 0? 1410;T= 321. 15K，Kn= 30. 59 和V_ = 0? 1371;T= 326. 15K,Kn= 32. 33 和Vnax= 0? 1238
[0026] 根据Km和Vmax的数据，用计算机拟合，得Km-T曲线方程，即
[0027]K"= 4398-27. 45T+0. 043T2,R= 0. 9930,求极值得中性蛋白酶催化大豆分离蛋白 水解最适温度为319. 19K。
[0028] 实验测得在T= 318. 15,不同酸度时中性蛋白酶催化反应的热功率一时间曲线 如图2，由图2可得到T= 318. 15K，不同pH(6. 13、6. 60、7. 10、7. 61、8. 03)时酶催化反应 的米凯利斯常数（Km)和最大速率（Vmax):PH= 6. 13,1= 29. 52和0. 1166;PH= 6.60，1(|11=27.71和￥_= 0.1328 屮11 = 7.101(|11= 26.64和￥_=0.1415丨11 = 7.61，1(|11 = 27. 23 和V_= 0? 1353;PH= 8. 03,K"= 29. 16 和Vmx= 0? 1236 用计算机拟合，可得K pH曲线方程，即K"= 175. 7-41. 80pH+2. 932pH2，R= 0? 9935,求极值得中性蛋白酶催化水解 大豆分离蛋白的最适pH为7. 13。
[0029] 实施例2
[0030]1?调浆
[0031] 将分离蛋白放入带有搅拌器的控温酶反应器罐中，加水调浆，浆料浓度约10% ;
[0032] 2?加酶反应
[0033] 调浆后，按底物蛋白重的1%加入碱性微生物蛋白酶，边加酶，边搅拌，随时加碱， 保持pH值~8. 25,搅拌速度=60r/min，酶解温度保持在329. 5K左右，酶解3小时后加加 与碱性蛋白酶1:3的中性蛋白酶，在319. 19K，pH7. 13水解lh。
[0034] 3?分离提取
[0035] 将酶解后的混合液灭酶处理，pH4. 5,使未