案，定义出反应池以及收集池，如图7所示；利用深硅刻蚀技术对硅进行刻蚀，刻蚀深度100 μ m，如图8所示；使用丙酮、异丙醇清洗硅片，除去硅片表面的AZ4620光刻胶后，可以制备出反应池以及收集池结构。通过本工艺的实施，可以获得包含反应池、收集池、分离磁区域以及收集磁区域的衬底结构，如图9所
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[0045]微流道系统的制备:首先依次使用丙酮、异丙醇以及超纯水对硅片进行超声清洗各15分钟，利用匀胶台在表面涂覆一层AZ4620光刻胶，涂覆厚度为10 μ m，利用紫外光刻获得微流道光刻胶图案，如图10所示；利用深硅刻蚀对硅片进行刻蚀，刻蚀深度50μπι，如图
11所示。对硅片进行氟硅烷处理，使表面呈现超疏水性质以便于后续微流道材料的剥离。将聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂覆到硅片表面并固化处理，如图12所示。固化后将PDMS去硅片表面剥离下来，如图13所示。进一步，利用打孔器在PDMS表面钻口，获得微流道进口与出口，二者之间的区域则为微流道系统中的通路，如图14所示。
[0046]微流道系统的集成:首先利用氧等离子体系统对微流道系统以及硅片衬底进行表面处理，获得超亲水的表面，然后将二者对准键合即可完成生物芯片的制备，如图2所示。
[0047](二)CK19 的富集
使用20nm Co纳米颗粒与邻硝基苄基衍生物分子、CK19抗体共同制备探针，并将探针预先固定到生物芯片的反应池中。在CK19富集的过程中，首先利用注射泵将含有Iyg/mLCK19的缓冲溶液样本通过微流道系统输送至芯片的反应池中并稳定4小时，以使CK19与探针充分结合；继续利用注射泵将溶液输送至微流道出口，在输送过程中，探针可以受分离磁区域的吸引而进入收集池中；在收集池中施加波长为365nm的光照，促进探针中的光致裂解分子断裂，分离磁性纳米颗粒以及肿瘤标志物；使用移液器收集已富集的CK19溶液，利用考马斯亮蓝法检测所富集的蛋白质浓度发现，最终富集浓度可达到75μ g/mL CK19。
[0048]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1.一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，包括衬底(9)以及微流道系统(10)，所述微流道系统(10)分布在衬底(9)表面，所述微流道系统(10)依次包括进样口(I)、通路(2)、反应池(3)、分离磁区域(4)、收集池(5)、固定磁区域(6)和出样口(7);所述进样口( I)通过通路(2 )与反应池(3 )连通，所述通路(2 )经过反应池(3 )后分出两个支路，其中第一支路与收集池(5)连通，第二支路与出样口(7)连通，所述分离磁区域(4)位于第一支路的一侧，所述固定磁区域(6)环绕收集池(5);所述反应池(3)内分布有磁性纳米颗粒标记的抗体作为探针，其中磁性纳米颗粒与抗体之间通过光致裂解分子连接。
2.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片是通过微流道系统(10)转移至衬底(9)表面，对准并键合固定而成。
3.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述衬底(9)的制备包括以下步骤: (1)清洗衬底，再在衬底表面均匀涂覆一层光刻胶； (2)利用紫外光刻技术制备磁性区域光刻胶图案，利用薄膜沉积技术，磁控溅射将磁性薄膜材料沉积于图案表面，结合剥离技术获得磁性区域，薄膜厚度为0.5 μ m~10 μ m ; (3)在衬底表面再均匀涂覆一层光刻胶，结合紫外光刻技术制备反应池与收集池的光刻胶图案； (4)使用深硅刻蚀或离子束刻蚀等技术刻蚀衬底，获得反应池与收集池结构；反应池与收集池的深度为100-500 μ m。
4.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述微流道系统(10)的制备和集成包括以下步骤: (1)利用紫外光刻技术在硅片表面制备微流道凸模，凸出结构高度50-500μ m ； (2)将微流道材料浇筑在凸模表面并固化，脱模后获得微流道结构； (3)对微流道结构表面进行亲水处理，获得具有超亲水性质的微流道系统。
5.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，所述衬底(9)为硅片或石英片制成；所述微流道系统(10)，其材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或SU-8胶。
6.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的材料为Fe3O4纳米颗粒、S1 2包裹的Fe 304纳米颗粒、FeCo纳米颗粒、FePt纳米颗粒以及Co纳米颗粒等中的一种；尺寸为5-50nm。
7.根据权利要求1所述一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述光致裂解分子包括邻硝基苄基衍生物，所述光照的波长为200-400nm。
8.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述分离磁区域(4)以及固定磁区域(6)，均由Fe304、FeCo、CoPt材料中的任意一种组成。
9.根据权利要求1所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，其特征在于，所述肿瘤标志物包括甲胎蛋白及其异质体、癌胚抗原、白介素-6、血清癌抗原、细胞角蛋白中的一种或多种。
10.权利要求1~9任一项所述的一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片的应用，其特征在于，包括以下步骤: (O首先利用注射泵或蠕动泵将待测样本通过微流道系统(10)输送至芯片的反应池(3)中并稳定1-12小时，以使待测样本中的目标肿瘤标志物与探针充分结合； (2)继续利用注射泵或蠕动泵将溶液输送至微流道出口，在输送过程中，探针可以受分离磁区域(4)的吸引而进入收集池(5)中； (3)在收集池(5)中施加光照，促进探针中的光致裂解分子断裂，分离磁性纳米颗粒以及肿瘤标志物； (4 )收集已富集的肿瘤标志物溶液并进行后续处理。
【专利摘要】本发明公开了一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，包括衬底以及微流道系统，微流道系统分布在衬底表面，微流道系统依次包括进样口、通路、反应池、分离磁区域、收集池、固定磁区域和出样口；进样口通过通路与反应池连通，通路经过反应池后分出两个支路，其中第一支路与收集池连通，第二支路与出样口连通，分离磁区域位于第一支路的一侧，所述固定磁区域环绕收集池；反应池内分布有磁性纳米颗粒标记的抗体作为探针，其中磁性纳米颗粒与抗体之间通过光致裂解分子连接。本发明还公开了实现肿瘤标志物富集的生物芯片的应用。本发明结构简单，可实现低浓度肿瘤标志物的高效富集，可满足检测领域在提升灵敏度等方面的应用需求。
【IPC分类】G01N33-574, G01N33-531
【公开号】CN104597242
【申请号】CN201510063576
【发明人】王彤, 张烨, 李增耀, 包增涛
【申请人】无锡市人民医院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月6日