一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片及其应用，属于检测技术领域。
[0002]
【背景技术】
[0003]恶性肿瘤是目前威胁人们身体健康的重大疾病之一，其在中国城镇居民中的发病率连年位居榜首，对其早期、快速、灵敏的诊断是挽救患者生命的重要途径。目前产业界以及科学界已经开发出多种策略进行肿瘤的检测，包括ELISA法、电化学法、影像学检测等，其中基于肿瘤特异性标志物的检测已被广泛使用，表现出了极大的应用价值。一般而言，肿瘤标志物在血液中的浓度较低，而在常规检测过程中不可避免地会使用样本前处理技术，如分离血细胞、缓冲液稀释等，造成了肿瘤标志物浓度的进一步降低，影响后续检测手段的灵敏度，同时限制了肿瘤发病早期时的检测应用需求。因此，开发出一种快速、高效肿瘤标志物富集技术具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的是提供一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，可以实现肿瘤相关标记物的高效富集，且操作简单，成本低廉。
[0005]本发明的第二个目的是提供了上述生物芯片的应用。
[0006]为实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案是:一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片，包括衬底以及微流道系统，所述微流道系统分布在衬底表面，所述微流道系统依次包括进样口、通路、反应池、分离磁区域、收集池、固定磁区域和出样口、所述进样口通过通路与反应池连通，所述通路经过反应池后分出两个支路，其中第一支路与收集池连通，第二支路与出样口连通，所述分离磁区域位于第一支路的一侧，所述固定磁区域环绕收集池；所述反应池内分布有磁性纳米颗粒标记的抗体作为探针，其中磁性纳米颗粒与抗体之间通过光致裂解分子连接。
[0007]上述生物芯片是通过微流道系统转移至衬底表面，对准并键合固定而成。
[0008]所述衬底的制备包括以下步骤:
(1)清洗衬底，再在衬底表面均匀涂覆一层光刻胶；
(2)利用紫外光刻技术制备磁性区域光刻胶图案，利用薄膜沉积技术，磁控溅射将磁性薄膜材料沉积于图案表面，结合剥离技术获得磁性区域，薄膜厚度为0.5 μ m~10 μ m ;
(3)在衬底表面再均匀涂覆一层光刻胶，结合紫外光刻技术制备反应池与收集池的光刻胶图案；
(4)使用深硅刻蚀或离子束刻蚀等技术刻蚀衬底，获得反应池与收集池结构；反应池与收集池的深度为100-500 μ m。
[0009]所述微流道系统的制备和集成包括以下步骤:
(I)利用紫外光刻技术在硅片表面制备微流道凸模，凸出结构高度50-500 μ m ； (2)将微流道材料浇筑在凸模表面并固化，脱模后获得微流道结构；
(3)对微流道结构表面进行亲水处理，获得具有超亲水性质的微流道系统。
[0010]所述衬底为硅片或石英片制成；所述微流道系统，其材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或 SU-8 胶。
[0011]所述磁性纳米颗粒的材料为Fe3O4纳米颗粒、S12包裹的Fe 304纳米颗粒、FeCo纳米颗粒、FePt纳米颗粒以及Co纳米颗粒等中的一种；尺寸为5_50nm。
[0012]所述光致裂解分子包括邻硝基苄基衍生物，所述光照的波长为200_400nm。
[0013]所述分离磁区域以及固定磁区域，均由Fe304、FeCo、CoPt材料中的任意一种组成。
[0014]所述肿瘤标志物包括但不限于甲胎蛋白及其异质体(AFP、AFP-L3)、癌胚抗原(CEA)、白介素-6 (IL-6)、血清癌抗原(CA199、CA742)、细胞角蛋白(CK19)等中的一种或多种。
[0015]一种实现肿瘤标志物富集的生物芯片的应用，包括以下步骤:
(O首先利用注射泵或蠕动泵将待测样本通过微流道系统输送至芯片的反应池(3)中并稳定1-12小时，以使待测样本中的目标肿瘤标志物与探针充分结合；
(2)继续利用注射泵或蠕动泵将溶液输送至微流道出口，在输送过程中，探针可以受分离磁区域的吸引而进入收集池中；
(3)在收集池中施加光照，促进探针中的光致裂解分子断裂，分离磁性纳米颗粒以及肿瘤标志物；
(4)收集已富集的肿瘤标志物溶液并进行后续处理；后续处理包括目标肿瘤标志物的提取以及纯化，同时还可以进行生物传感测量以检测样本中肿瘤标志物的含量等处理。
[0016]所述样本为全血、血清或磷酸盐缓冲液(PBS)；
在反应池内分布有磁性纳米颗粒标记的抗体作为探针，其中磁性纳米颗粒与抗体之间通过光致裂解分子连接；抗体可以与目标肿瘤标志物发生特异性结合；芯片表面的分离磁区域可以选择性地吸引磁性纳米颗粒流动至收集池；在收集池中施加一定波长的光照可以促进光致裂解分子断裂，使得磁性纳米颗粒与肿瘤标志物分离，从而实现了样本中肿瘤标志物的富集。
[0017]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点包括:
(1)本发明通过使用磁性纳米颗粒结合样本中的目标肿瘤标志物，结合分离磁区域，可以实现磁性纳米颗粒在微流道系统中的分流，选择性地流入芯片表面的收集池，促进了肿瘤标志物的高效富集；
(2)利用光照技术结合分离磁区域实现了磁性纳米颗粒与肿瘤标志物的分离，有效降低了样本中的磁性纳米颗粒残留，提高了富集后的肿瘤标志物纯度；
(3)本发明所涉及的生物芯片适应全血样本，可避免因样本前处理过程而造成肿瘤标志物的损失，能够满足后续检测应用需求。
【附图说明】
[0018]图1本发明所涉及一种肿瘤标志物富集的生物芯片形貌俯视图；1_微流道系统中的进样口，2-微流道系统中的通路，3-衬底表面的反应池，4-衬底表面的分离磁区域，5-衬底表面的收集池，6-衬底表面的固定磁区域，7-微流道系统中的出样口 ； 图2本发明所涉及生物芯片的剖面图:8_磁性纳米颗粒探针，9-衬底，10-微流道系统；
图3本发明芯片加工过程中，衬底表面涂覆一层光刻胶剖面图:11_光刻胶；
图4本发明芯片加工过程中，经过紫外光刻后，衬底表面的光刻胶图案剖面图，图中以芯片表面的分离磁区域为示意；
图5本发明芯片加工过程中，衬底表面沉积的磁性薄膜材料，本图以分离磁区域的材料为示意；
图6本发明芯片加工过程中，在图5的基础上，制备反应池以及收集池的过程中，在芯片表面均匀涂覆一层光刻胶剖面图；
图7本发明芯片加工过程中，经过紫外光刻后，衬底表面的光刻胶图案剖面图；
图8本发明芯片加工过程中，利用刻蚀工艺获得反应池以及收集池剖面图；
图9本发明芯片加工过程中，经过去胶工艺后得到的衬底结构剖面图；
图10制备微流道系统过程中，首先利用匀胶工艺以及紫外光刻工艺在硅片衬底表面获得光刻胶图案剖面图；
图11制备微流道系统过程中，经过去胶工艺后获得的硅片凸模；
图12将微流道材料浇筑在硅片凸模表面示意图，10-微流道材料；
图13经过脱模工艺处理后的微流道剖面图；
图14利用打孔器定义出微流道进口、出口剖面图；
图1