的A和B分别进行染色的样品的FL2比例求得的常数。因此，对于每个检测出的细胞，能够求出x/y的值。如图11⑶所示，将纵轴表示为FL1/FL2的对数比例，则该轴的值为依赖于x/y的分布。作为图1l(B)的横轴，通过采用表示细胞大小的前方散射信号强度(FS)，能够同时表示x/y信息与细胞大小信息。横轴也可以取FS意外的信号。本发明中，如该FL1/FL2那样，将成为分析重要的量的数据作为分析的指数(index)，表示为图表的轴，从而实现将多维信息汇总成一维信息并进行表示，以及通过对该指数设定阈值来实现定量判定。
[0187]下面，对上述数据分析的实施例进行说明。图12中表示在使用透过生物膜的核染色剂SYT09和不透过生物膜的核染色剂PI两种核染色剂并分析存活判定的情况下的现有分析方法。与此相对，本发明定义了用于存活判定的指数，以用该指数设定的阈值为基础自动进行存活判定。用图12和图13对该方法进行说明。FLl的波长区域约为500nm至550nm，FL2的波长区域为570nm至610nm。如图12的分布所示，现有的存活(LIVE) &死亡(DEAD)分析区分为存活分布(仅用SYT09染色的分布)与死亡分布(用SYT09与PI两者进行染色的分布)。这种区分方法依赖于人的图像识别。因此，本发明中，为了自动判定存活和死亡，制作了定量指数，在该指数上设定判定的阈值，作为区分存活与死亡的方法。具体地，为了分析细胞的存活&死亡，用透过细胞膜的核染色剂SYT09与不透过细胞膜的核染色剂PI两种染色剂，用如下草案进行染色。准备在ImL的PBS中加入了 1.5 μ L 3.34mM的SYT09与1.5 μ L 30mM的PI的染色溶液，从该溶液中取2 μ L加入到200 μ L的样品液中，在黑暗条件下进行20分钟染色反应。
[0188]图12为通过上述处理，将称为MCF-7的细胞进行染色并测量的结果。在该散布图中，存活分布为仅用SYT09进行染色的细胞的分布，表示一个线性分布。另一方面，死亡分布由于利用细胞膜的破损而也被PI染色，因此为双重染色状态。在该分布中，SYT09的染色量与PI的染色量之间的比例几乎一定。因此，死亡分布的位置与存活分布的位置相比向下方偏离，呈直线分布。
[0189]下面如公式9所示，在考虑FL1/FL2时，其值的对数表示直线的纵轴截距。因此，FL1/FL2的对数，在比较存活分布的值与死亡分布的值时，存活分布的值变大。图13为用上述方法调查抗菌剂对绿脓菌的效果的图表。其为使抗菌剂混入一定时间后，用SYT09和PI染色20分钟，测定FL1/FL2的柱状图分布。在不混入抗菌剂的情况下，表示单一峰的分布，但如果混入抗菌剂，则产生小值的分布，如果提提高抗菌剂的浓度，则可得到小值的分布比例变大的结果。图13中用虚线表示的值为存活判定的阈值，其为通过预先分别测定100%活菌和100%死菌获得的分布界限来设定的值，以该阈值为基准，能够自动进行存活判定。因此，可知FL1/FL2作为自动判定存活的指数是有效的。若将上述内容用公式进行说明时，如下所示。如公式9所示，在考虑FL1/FL2时，如变形为公式10可知，该值的对数表示图12中图表直线的纵轴截距。因此，随着FL1/FL2从存活变化为死亡，能够推测到值会变小，因此适合作为存活分析的指数。
[0190]FL1/FL2 =Δ (9)
[0191]LogFLl = LogFL2+Log Δ (10)
[0192]图14为相对于目前用作存活分析的图12的散布图，将同一测定结果用使用了本发明的存活判定指数的散布图进行表示。将纵轴设为FL1/FL2，进一步地，将横轴设为表示细胞大小的前方侧散射强度信号FS，从而实现了将细胞的存活信息与细胞大小信息在一个二维散布图中进行表达。在该图14的散布图中，对于测定样品MCF-7细胞，表示出死亡细胞的大小小于存活细胞的大小的结果。
[0193]如上上述，作为流式细胞仪的多维数据的表示方法，根据测定目的，采用由信号强度间的运算式定义的指数作为图表显示的轴，从而能够增加用二维散布图表达的信息量。图15为对细胞的两种表面标记，一个用FITC焚光标记抗体染色，另一个用PE焚光标记抗体染色的样品的测定数据中，用PE/(FITC+PE)作为纵轴，用FS作为横轴的表示例。在此，PE及FITC为荧光校正后的荧光量，是与各自的荧光分子数成比例的量。该指数是作为表示两种表面标记的表达比例的量来进行定义的，图15为在一张图表中表示两种表面标记的表达比率对细胞大小依赖性的表示例。根据该指数的值，能够对每个细胞分析关于各个细胞的表达比例的过量和不足。此外，作为用来评价检测的细胞是一个细胞还是多个聚集的细胞的指数，可以定义(信号脉冲面积)/(信号脉冲时间长短)等。白细胞等浮游类细胞以单一细胞状态流动，但血液中的癌细胞等不限于以单一状态在血液中循环。在这种评价中，与是否聚集无关，需要评价细胞数。该指数在分析是否聚凝中发挥作用。
[0194]如上上述，这种通过多个信号之间的运算，定义适合分析内容的指数，用该指数的值定量评价各个细胞的特性的方法具有很多优点。作为其优点有:通过将多维信息汇总为一个指数，能够用一个二维散布图表达基于三种以上信号的信息；通过预先对该指数设定判定阈值，实现对各个细胞的定量判定。该方法在定量医疗诊断中有效。
[0195]工业实用性
[0196]本发明适合用作无残留、无交叉污染的I)细胞分选仪、2)能够检测侧方散射光的流式细胞仪、3)准确检测细胞密度的装置、4)不需要荧光校正的多重染色分析装置，以及使用这些装置的细胞分离、分析方法等。
[0197]附图标记说明
[0198]I…样品液流道
[0199]2…鞘液流道
[0200]3…照射.光
[0201]4-1…分选流道(“拉”侧)
[0202]4-2…分选流道(“推”测)
[0203]5…分选IC液室
[0204]6…过滤器
[0205]7-1、7-2 …电磁阀
[0206]8-1…负压定压泵
[0207]8-2…正压定压泵
[0208]9-1…分离对象细胞
[0209]9-2…非分离对象细胞
[0210]10…样品液IC液室
[0211]11…回收样品液IC液室
[0212]20…鞘液贮液室
[0213]22…鞘液用端口
[0214]23…鞘液回收端口
[0215]24…鞘液回收端口
[0216]25…芯片用基板
[0217]27…流道
[0218]31…样品液贮液室
[0219]32…鞘液用端口
[0220]34…废液贮液室
[0221]35…回收样品液IC液室
[0222]36…样品液
[0223]37…鞘液贮液室
[0224]39-1、39-2…侧方散射检测用反射面
[0225]40…激光束扫描区域
[0226]41…流道
[0227]50…激光光源
[0228]51...物镜
[0229]52...激光
[0230]53…被分选流道4-1与4-2夹着的区域。
[0231]54、55、56 …二向色镜
[0232]57、58、59…带通滤波器
[0233]60…透射激光遮断用空间过滤器
[0234]61...光电二极管
[0235]62、63…光电倍增管
[0236]64…AD转换器
[0237]69…AD转换器
[0238]70...键盘
[0239]71…显示装置
【主权项】
1.一种流动室装置，用于在流道内流动样品液的状态下，分离包含在样品溶液中的粒子，其特征在于， 所述流动室的结构如下:在透明基板中形成有流道，在所述流道的上游侧与下游侧的基板上部分别形成有与所述流道进行流体连接(fluidly connected)的液室； 所述流动室具有形成于所述透明基板上的所述样品液的导入用流道和设置在其两侧的一对鞘液导入用流道、合流流道以及一对分支流道； 所述合流流道，是所述所述样品液的导入用流道与设置在其两侧的所述一对鞘液导入用流道合流而成，所述鞘液夹着所述样品液，在其两侧流动； 所述一对分支流道，其对置地连接于所述合流流道的侧面； 所述一对分支流道具有能够与外部泵进行气密连接的端口。
2.一种流式细胞仪，其特征在于，其具有照射光源和荧光测定装置，所述荧光测定装置的结构为检测多个波长区域的荧光； 在分析包含多个荧光分子的细胞中，具有将由光照射产生的波长不同的两种荧光强度的比，对每个细胞导出分布并进行显示的功能； 还具有根据其值来评价包含在细胞中的多个荧光分子的丰度的功能。
3.一种液体中微粒的检测装置，其特征在于，其具有: 流动室，在平板基板内形成流道； 照射光源，其在流动室中将样品液中的微粒与鞘液一起在所述流道中流动的状态下，对样品液中的微粒照射光； 检测装置，检测在照射所述光时由所述微粒产生的散射光或荧光，基于它们的信号强度对所述微粒进行识别，检测目标微粒；以及， 控制、分析部，控制所述各部，基于来自所述检测装置的信息，分析所述微粒， 利用表示在所述样品液完全流完的时刻所产生的气泡的信号，通过探测所述样品液检测的终点，对包含在全部所述样品液中的粒子数进行定量。
4.一种生物粒子分析装置，其特征在于，其具有照射光源与光测定装置，所述光测定装置的结构为在多个波长区域中检测通过照射光而由每个微粒产生的光； 所述生物粒子分析装置具有以下功能，对每个粒子，根据与粒子的测定项目相对应的多个信号强度间的运算来求得指数，基于该指数的值来分析粒子特性。
5.根据权利要求4所述的生物粒子分析装置，其特征在于，其具有运算装置，所述运算装置在对使用透过细胞膜的染色剂与不透过细胞膜的染色剂同时染色的细胞或细菌进行存活判断的测定分析的情况下，将由光照射产生的波长不同的两种荧光信号强度的比作为指数，基于该指数的值，判定是死细胞还是活细胞。
6.一种生物粒子分析装置，其特征在于，其具有照射光源和光测定装置，所述光测定装置的结构为在多个波长区域检测通过照射光而由每个微粒产生的光， 对每个粒子，导出用多个信号强度间的运算式定义的指数，能够选择该指数作为数据显不图表的轴。
【专利摘要】本发明实现无残留、无交叉污染的细胞分选仪、能够检测侧方散射光的流式细胞仪、准确检测细胞密度、不需要荧光校正的多重染色分析。本发明提供一种微粒分离装置，其具有：流动室，在平板基板内形成流道；光照射装置，对流经流道的样品液中的微粒照射光；检测装置，检测在照射光时由微粒产生的散射光或荧光，基于它们的信号强度对微粒进行识别，检测目标微粒；定压泵以及与定压泵连接的电磁阀，所述定压泵对在流动室的流道中流动的样品液中的微粒施加压力脉冲；以及，控制装置，基于来自检测装置的信号，控制电磁阀的动作。
【IPC分类】B01L3-00, G01N15-14
【公开号】CN104549584
【申请号】CN201410838645
【发明人】武田一男
【申请人】芯片生物技术株式会社
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2011年1月11日
【公告号】CN102753955A, CN102753955B, EP2525209A1, US20120288920, WO2011086990A1