一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪的利记博彩app
【专利说明】一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪
[0001]本申请是申请日为2011年01月11日，申请号为201180006138.7，发明名称为一次性芯片型流动室与利用其的细胞分选仪的分案申请。要求日本在先申请JP2010-007295的优先权，优先权日为2010年I月15日。
技术领域
[0002]本发明涉及一种流式细胞仪等具有生物粒子分析功能的装置或细胞分选仪等具有流动室分离功能的装置，用该装置实现新功能的测定方法，以及一次性流动室芯片。
【背景技术】
[0003]流式细胞仪通常被广泛用于鉴别各种类型的细胞及生物学粒子。现有的流式细胞仪通常采用石英制成，具有光学上透明的流动室，所述流动室形成有流道，以使能够形成通过其并应被一个一个地识别的细胞流。该流道中流动的细胞流利用同心包围该细胞流的鞘液，从而集中于流道的中央部流动。该流道的中央部被激光束照射，细胞通过该照射区域时，产生依赖于细胞大小、形状、折射率的光散射。该激光的波长通过与荧光色素种类的配合来决定，以用来用荧光检测由荧光色素进行特异性染色的细胞。像这样，通过对每个细胞，除散射光之外，还利用多个光检测器按照不同波长检测荧光，从而能够以多个角度分析细胞。上述流式细胞仪的技术记载于专利文献I中。并且，关于平板状的流动室记载于特开平第2003-302330(专利文献10)及美国专利第7105355号(专利文献11)中。利用一次性芯片的流式细胞仪记载于专利第4358888号(专利文献14)中。
[0004]下面对细胞分选方法的公知实例进行叙述。美国专利第3710933号(专利文献I)及美国专利第3826364号(专利文献2)中记载的方法为现有一般产品中所用的分离方法，从用于形成液滴的喷嘴中将样品液作为液滴向空气中吐出，通过电场，将包含分离对象细胞的液滴以液滴单位进行分离的方法。特开昭第64-3541(专利文献3)公开了如下方法:使鞘流在流动室中流动的样品液的周围流动，通过对样品液施加电场，从而使带电的粒子从样品流向鞘流的方向移动，并分离检测。特开平1-170853号(专利文献4)中记载了如下方法:对在流动室中流动的粒子施加压力脉冲，将粒子分离到流动室内非平稳流动的流道中。国际公开号为W098/10267号(专利文献5)中公开了如下技术:对在流动室中周围被鞘流挤压流动的微粒施加场，使微粒流发生偏移并进行分离。国际公开号为W02004/101731号(专利文献6)中公开了如下方法:利用设置于流动室中流道两侧的凝胶电极，将液体中带电的细胞用电场进行分离。美国专利第6808075号(专利文献7)中公开了如下方式:通过垂直形成弯液面的气泡阀来对粒子流施加压力脉冲，使流发生偏移并分离。W02006/076195号(专利文献8)公开了一种以水滴单位射出并回收到容器中的方法，所述水滴单位含有以同专利文献5—样施加物理冲击脉冲为目的的粒子。美国专利第4756427号(专利文献9)中记载了如下方法:测定被鞘流挤压的样品液流中的粒子，在判断为目标微粒的情况下，利用压电原件，通过脉冲流将其导入到其它流道，进行分离。
[0005]专利文献12中记载的细胞分离方法，其是通过在油内形成含有细胞的液滴并使其流动，从而通过静电场，使力作用于含有目标细胞的液滴的方法。专利文献13中采取了以下方法:在流动室中的流道上形成细胞分选用的支流道，利用压电原件产生脉冲流，将所需的细胞引入到分选流道中。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:美国专利第3710933号
[0009]专利文献2:美国专利第3826364号
[0010]专利文献3:特开昭64-3541号公报
[0011]专利文献4:特开平1-170853号公报
[0012]专利文献5:国际公开号TO98/10267
[0013]专利文献6:国际公开号TO2004/101731
[0014]专利文献7:美国专利第6808075号
[0015]专利文献8:国际公开号TO2006/076195
[0016]专利文献9:美国专利第4756427号
[0017]专利文献10:特开2003-302330号公报
[0018]专利文献11:美国专利第7105355号
[0019]专利文献12:W02009/021215
[0020]专利文献13:特开昭61-137062号公报
[0021]专利文献14:专利4358888
【发明内容】
[0022]本发明要解决的技术问题
[0023](1.送液系统的问题)
[0024]现有的细胞分选仪，其送液系统存在生物危害方面的问题。即，这是因为其为以下结构，发生外部异物向测量样品内的混入及测量样品向外部扩散。即，不能简单地更换试样液的贮液室、送液泵及具有流动室的送液系统，现有的流式细胞仪，为了降低残留，在每次测量不同的样品时必须进行洗净。将粒子分离功能附加到流式细胞仪上，这种细胞分选仪也同样存在这一问题。作为解决该问题的方法之一，是使流动室能够一次性使用。为了能够做成一次性的，流动室适合使用如载玻片那样的平板状结构。即，因为该结构能够通过射出成型等容易地形成流道样式，且能够廉价批量生产。在使用平板状流动室的情况下，适合使用将照射激光从表面垂直入射的方法。但是，在检测向平板面内侧方向的散射光即侧方散射光方面存在问题。检测侧方散射光的意义在于获得细胞内部结构的信息，对于通常的流式细胞仪来说是必须具备的功能。通常的流式细胞仪的流动室，其流动室的横截面一般为正方形，对检测与激光照射方向垂直的方向的散射光没有问题，且可与前方散射光同时检测。但是，使用平板型流动室的情况下，由于侧方散射光的方向上存在流动室基板，因此流动室的平板结构本身成为测量的障碍。作为解决这一问题的方法，专利文献11记载有以下方法。在流动室的流道侧面设置光纤，将流道内发出的光导出至光检测器。但是，这种情况下，由于光纤连接到流动室，因此不适合每次检测都更换流动室，因此不能适用于一次性用途的流动室。作为本发明人之前的发明，专利文献14的利用一次性芯片型流动室的流式细胞仪中，不包括检测侧方散射光的功能。
[0025](2.流动室的问题)
[0026]此外，如果不能以廉价制备流动室，则难以成为一次性产品。为了以廉价制备，用透明树脂制备为宜。但是，树脂在波长小于500nm的短波长区域，存在很小的光吸收带并发出荧光，因此成为检测的背景噪声。即，适合一次性的由透明树脂制备的流动室的情况下，本身的荧光成为检测的障碍。
[0027](3.细胞分离方法的问题)
[0028]对细胞分选的问题进行叙述。作为第一问题，存在生物危害对策方面的问题。
[0029]专利文献I或专利文献2中所述的利用喷嘴来吐出液滴，通过电场，将包含分离对象细胞的液滴以液滴单位进行分离的方法(喷气方式)，在生物危害对策方面存在问题。即，样品为被病原性病毒或细菌污染的细胞的情况下，具有将非常危险的物质作为气溶胶扩散到大气中的风险。作为解决第一问题的方法，考虑了将气溶胶密闭在流动室内，而不使其扩散到大气中，在此状态下进行分离的方法。作为这种方法，公开有以下几种技术。专利文献3公开了一种鞘流在流动池中流动的样品液的周围流动，通过对样品液施加电场，利用电场使带电粒子从样品流向鞘流方向移动来进行分离检测的方法。专利文献4公开了一种对在流动室中流动的粒子，施加由压电原件产生的压力脉冲，将粒子分离到流动室中的非平稳流动的流道的方法，但是，在该方法中，为了避免分离的粒子返回原流道，需要形成空气稳流等，存在控制复杂的问题。专利文献5中公开了一种使鞘流在流动室内流动的样品液的周围流动，挤压样品液流，对样品液中的微粒施加电场或磁场等场，从而使微粒流发生偏移来进行分离的技术。在该方法中，使用电场作为场的情况下，相当于上述专利文献3中的内容。这种利用电场的方法，与专利文献6中的方法相同，即使采用一些方法来防止因电分解产生气泡，细胞所具有的电荷也会被周围电解质中所含的离子屏蔽，降低作用于粒子的力，因此对于电解质中的分离并不实用。专利文献7中公开了一种在芯片内的细胞分离技术。其是通过从侧面的压力使一个微粒流偏移，并在下游进行分离的方法。但是，为了施加压力，需要弯液面的往返运动，由于在来回往返中会产生逆方向流，因此，需要在等到粒子足够远后将弯液面位置回复到原位置。专利文献8公开了如下方法，其同专利文献4 一样，通过施加物理冲击脉冲，将包含目标细胞的区域以水滴单位射出，并回收到容器中。上述内容在一次性流动室芯片内不能实现，存在与其它样品间的污染。专利文献9的方法不适用于一次性芯片。专利文献12的方法，其是通过在油内形成包含细胞的液滴并流动，对包含目标细胞的带电液滴作用静电力，从而进行分离的方法。这种情况下，具有以下优点，在油内不存在屏蔽静电力的离子，但是在高粘性的油中，在分选比细胞大的液滴时，具有速度慢的缺点。如专利文献13记载的那样，利用压电原件产生脉冲流使细胞分离到支流道中的方法，该方法的流动室与压电的连接也没有以一次性作为前提。如果将压电原件组装到流动室的情况下，流动室的价格会变得昂贵，因此不适用于一次性芯片。
[0030](4.应对多个待测样品的流式细胞仪的问题)
[0031]下面，对应对多个待测样品的流式细胞仪的问题进行叙述。通常的流式细胞仪采用以下方法作为应对多个待测样品的方法:将96孔板自动放置在XYZ载置台上，并依次进行检测。这种方法，由于轮流使用送液系统，因此会产生残留及待测样品间的交叉污染。因此想到了在形成多个流道的芯片中，以低廉的运营成本，在短时间内检测多个待测样品的方法。这种情况下，如上所述的那样，侧方散射光的检测成为难点。在形成多个流道的情况下，如专利文献11中所记载的方法那样，想到了将光纤插入流道的侧面，通过光纤将信号光导入检测器中，检测侧方散射的方法，但是包含光纤的一次性芯片并不实用。
[0032](5.利用一次性芯片检测准确浓度的问题)
[0033]下面，在利用一次性芯片的检测中，对测量样品的准确浓度进行检测的情况下的问题进行叙述。由于细胞因重力而沉降，样品液的细胞浓度，有底面附近的密度随时间增大的现象。尽管存在这种现象但为了检测准确浓度，需要检测全部的样品液。这种情况下存在以下问题:例如，作为已知例的专利文献14中所记载的芯片，当放入样品液进行检测时，在样品液刚消失时，会产生气泡，在细胞的检测数据中会混入气泡数据。这种气泡的产生，成为检测细胞的准确个数的障碍。
[0034](6.数据分析的问题)
[0035]下面，对流式细胞仪的数据分析方面的问题进行叙述。流式细胞仪的多色分析一般进行荧光校正。但是，在该荧光校正中，从分布于检测波长不同的多个检测器间的多个信号强度中，每个荧光标签校正一个信号强度，因此在测量前需要使用测定用样品进行装置调节。因此，测定用样品为了获得测常数据和调节装置，需要仅荧光色的数量并单独进行染色的样品。并且，荧光检测器至少需要三个以上，即，具有三种以上颜色。在这种状况下，可以用二维图表显示二维数据，但在现有的流式细胞仪中存在三维数据的分析和显示方面的问题。即，用多个二维显示或可旋转显示的三维显示来进行，不能实现可立即理解的显示。
[0036]解决技术问题的技术手段
[0037]本发明鉴于上述情况，提供一种使用以下一次性芯片型的流动室来分析识别生物粒子并进行分离的装置，以及一次性流动室。
[0038][I] —种粒子分离装置，其具有: